拟南芥渗透胁迫应答基因的筛选及功能分析

论文摘要

逆境胁迫因子如高盐、干旱、低温等大大限制了植物的生长发育,是导致粮食作物减产的重要因素。随着我国人口数量的不断膨胀,耕地面积的不断减少,如何有效利用沙化、盐碱地已成为我国粮食作物生产所面临的严峻问题。通过植物基因工程技术改良物种,使作物具有较高的抗渗透胁迫能力,是解决这一问题的有效途径。目前,植物抗渗透胁迫基因工程的研究热点主要集中在如何提高植物的抗渗透胁迫能力上,而从大量的胁迫相关基因中筛选出抗渗透胁迫的关键基因是植物抗渗透胁迫基因工程的关键。本研究以前期通过生物信息学手段预测得到的拟南芥渗透胁迫相关基因为基础,采用real-time PCR方法,对预测基因进行筛选。将筛选到的渗透胁迫应答基因转化烟草,验证基因的功能。获得了2个具有抗渗透胁迫功能的新基因。该研究结果为前期的基因功能预测工作提供了实验证明,也为植物抗渗透胁迫基因工程提供了新的基因资源。取得的主要研究结果如下:1.Real-time PCR筛选渗透胁迫应答基因通过real-time PCR方法对8个拟南芥基因在渗透胁迫前后的表达水平进行了检测,得到了4个渗透胁迫条件下上调表达的基因,分别命名为AtMYB126,AtIMP,AtDBP1,AtDBP2。2.植物表达载体的构建通过RT-PCR克隆了上述4个渗透胁迫应答基因,构建了由组成型启动子CaMV35S调控的植物表达载体pBMYB,pBIMP,pBP1,pBP2,将其导入到农杆菌BLA4404,以用于下一步转化烟草。3.烟草的遗传转化以烟草“龙江911”为受体材料,利用农杆菌介导法将上述4个植物表达载体进行遗传转化,获得抗性植株。4.转基因植株的筛选及抗逆性检测抗植株扣叶盘,置于含Km的分化培养基上进行二次筛选,得到遗传背景完全一样的转基因烟草。转AtMYB126基因的30个株系二次筛选得到25个分化株系;转At1MP基因的31个株系二次筛选得到25个分化株系;转AtDBP1基因的24个株系二次筛选得到21个分化株系;转AtDBP2基因的24个株系二次筛选得到20个分化株系。对二次筛选得到的幼苗进行抗盐性及抗旱性检测。共获得转AtDBP1基因的抗盐植株11个,其中既抗盐又抗旱的植株4个;获得转AtDBP2基因的抗盐株系11个,其中5个株系既抗盐有抗旱;AtMYB126、AtIMP在逆境胁迫下的表现与对照植株并无明显差异。5.抗逆转基因植株的分子检测对具有抗逆性的植株进行了PCR检测及real-time PCR检测。对转AtDBP1基因的12个耐盐株系进行PCR检测,获得阳性植株10个,从中选取5个抗性较好株系进行real-time PCR检测,结果表明AtDBP1基因在2个株系中超量表达;对转AtDBP2基因的11个耐盐株系进行PCR检测,获得阳性植株9个。选取5个抗性较好的株系进行real-time PCR检测,结果发现AtDBP2基因在4个株系中超量表达。6.抗性植株的生理指标检测对real-time PCR检测超量表达的株系进行生理指标的检测。相对电导率测定结果表明,real-timePCR检测超量表达的抗性株系胁迫处理后的相对电导率与对照株系相比保持在相对稳定的水品;叶绿素含量的测定结果表明,real-time PCR检测超量表达的抗性株系胁迫处理后的叶绿素含量降低幅度要小于对照株系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 植物渗透胁迫应答机制
• 1.2.2 渗透胁迫应答相关蛋白
• 1.2.3 植物抗渗透胁迫基因工程研究进展
• 1.2.4 基因功能的研究方法
• 1.3 课题来源与本论文的主要研究内容
• 1.3.1 本研究课题的来源
• 1.3.2 本论文的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 Real-time PCR筛选抗渗透胁迫功能基因
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 目的基因的克隆
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 植物表达载体的构建
• 2.3.1 试验材料
• 2.3.2 试验方法
• 2.4 农杆菌介导的遗传转化及抗性植株再生
• 2.4.1 试验材料
• 2.4.2 试验方法
• 2.5 抗逆性检测
• 2.5.1 试验材料
• 2.5.2 试验方法
• 2.6 抗逆植株分子检测
• 2.6.1 试验材料
• 2.6.2 试验方法
• 2.7 抗逆植株生理指标检测
• 2.7.1 NaCl胁迫处理
• 2.7.2 NaCl胁迫下相对电导率的测定
• 2.7.3 NaCl胁迫下叶绿素含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 Real-time PCR筛选预测的抗渗透胁迫功能基因
• 3.1.1 拟南芥总RNA的提取
• 3.1.2 Real-time PCR筛选上调表达基因
• 3.2 目的基因的克隆
• 3.2.1 PCR扩增目的片段
• 3.2.2 目的片段序列分析
• 3.3 植物表达载体的构建
• 3.3.1 植物表达载体pBMYB的构建
• 3.3.2 植物表达载体pBIMP的构建
• 3.3.3 植物表达载体pBP2的构建
• 3.3.4 植物表达载体pBP1的构建
• 3.4 遗传转化及抗性植株再生
• 3.4.1 卡那霉素筛选压力的确定
• 3.4.2 目的基因对烟草的遗传转化及抗性植株再生
• 3.5 抗性检测
• 3.5.1 抗盐检测
• 3.5.2 抗旱检测
• 3.6 抗性植株分子生物学检测
• 3.6.1 抗盐及干旱植株的PCR检测
• 3.6.2 抗盐及干旱植株的real-time PCR检测
• 3.6.3 抗性植株生理指标的检测
• 4 讨论
• 4.1 Real-time PCR在实验中的应用
• 4.2 抗性植株的二次筛选对筛选质量的优化
• 4.3 AtDBP1、At DBP2基因功能分析
• 4.4 下步工作展望
• 5 结论
• 5.1 real-time PCR筛选预测基因
• 5.2 植物表达载体的构建
• 5.3 遗传转化体系建立及Km抗性筛选
• 5.4 抗性植株生物学检测
• 5.5 分子生物学检测
• 5.6 杭性植株生理指标检测
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文