新城疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

论文摘要

新城疫（Newcastle disease）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus）引起的鸡和多种禽类的急性,高度接触性传染病。世界卫生组织将其为A类动物疫病,该病危害世界养禽业最严重的传染病之一,由于其传播速度快,给养禽业带来了巨大的经济损失,尤其是养鸡业,因此,预防、控制该病是我国目前以及今后相当长的一段时间内面临的一项艰巨任务,因此对于新城疫病毒诊断试剂合的研究具有重要的意义。为了建立新城疫病毒检测方法,我们首先要制备抗新城疫病毒单克隆抗体。本研究首先把NDV超离纯化的全病毒抗原免疫6—8周龄BALB/c雌性小鼠,基础免疫和加强免疫之后,采血测定抗体滴度。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%PEG作用下融合。分别用全病毒包被ELISA方法,血凝抑制试验（HI）和间接免疫荧光法（IFA）筛选阳性细胞,阳性细胞经有限稀释法反复克隆培养,最后获得5株NDV特异性单克隆抗体,分别为1F10、2H3、4E4、5B11、5E9。接着向BALB/c小鼠腹腔接种阳性杂交瘤细胞,1周后采腹水,离心取上清液,各株McAb腹水效价测定显示,NDV特异性McAb效价都符合双抗体夹心ELISA检测方法的建立,此5株单抗都没有血凝抑制效价。这五株杂交瘤细胞分泌的抗体均有良好的热稳定性。腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,蛋白含量为2.65mg/mL—3.71mg/mL之间。特异性试验结果表明,5株McAb中,两株McAb与禽流感病毒（AIV）,甲型流感病毒,鸡马立克氏病（MDV）、网状内皮组织增殖症病毒（REV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）以及鸡产蛋下降综合征（EDS—76）均无交叉反应,此结果表明所得的两株单抗是针对NDV特异性单抗。此2株单克隆抗体的获得为新城疫病毒快速检测奠定了基础。本研究在研制出新城疫病毒特异性单克隆抗体的基础上,以单抗2H3作为包被抗体,4E4-辣根过氧化物酶标记（4E4-HRP）作为检测抗体的配对,建立了检测特异性新城疫病毒的双抗体夹心ELISA方法。通过对各步反应条件进行优化,最终获得的最佳工作条件为：单克隆抗体为1：1600倍稀释,HRP酶标记抗体为1:320倍稀释,包被抗体最佳反应条件为4℃过夜,HRP酶标抗体的最佳工作条件为37℃,45min。用建立的双抗体夹心ELISA方法对以知的REV、IBDV、RBV、IBV、EDS—76及AIV等禽类病毒进行了交叉反应性试验,此试验结果表明无交叉反应性。本方法特异性强,灵敏度高,可以用于NDV的快速检测及鉴别诊断。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 文献综述
• 1.1 新城疫病毒的研究进展
• 1.1.1 新城疫的命名与流行
• 1.1.2 NDV生物学特性
• 1.1.3 NDV的形态结构
• 1.1.4 NDV的基因组及编码蛋白
• 1.2 单克隆抗体的研究进展
• 1.2.1 单克隆抗体
• 1.2.2 杂交瘤技术
• 1.3 新城疫诊断技术的研究进展
• 1.3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.3.2 荧光抗体技术
• 1.3.3 RT-PCR
• 2. 研究目的和意义
• 3. 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 耗材及主要仪器
• 3.3 试剂配制
• 3.4 试验方法
• 3.4.1 全病毒纯化抗原的制备
• 3.4.2 抗原最佳包被浓度与对照血清最佳稀释度的确定
• 3.4.3 小鼠免疫程序
• 3.4.4 细胞融合
• 3.4.5 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 3.4.6 杂交瘤细胞的克隆化,冻存与复苏
• 3.4.7 杂交瘤细胞的染色体分析
• 3.4.8 抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定
• 3.4.9 杂交瘤细胞稳定性测定
• 3.4.10 腹水单克隆抗体的效价测定
• 3.4.11 腹水单克隆抗体的纯化
• 3.4.12 单克隆抗体蛋白质含量的测定
• 3.4.13 单克隆抗体纯度的鉴定
• 3.5 双抗体夹心ELISA方法的建立
• 3.5.1 单克隆抗体的标记与酶标记抗体亲和层析法纯化
• 3.5.2 抗体最佳包被浓度与酶标记抗体最佳工作浓度的确定
• 3.5.3 双抗体夹心ELISA阴阳性界限的确定
• 3.5.4 特异性试验
• 3.5.5 重复性试验
• 3.5.6 敏感性试验
• 3.5.7 临床样品的检测
• 3.5.8 对新城疫病毒疫苗株和野毒株的检测
• 4. 结果与分析
• 4.1 全病毒纯化抗原的制备
• 4.2 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定
• 4.3 免疫小鼠抗体效价的检测
• 4.4 细胞融合
• 4.5 单克隆抗体的筛选与单克隆阳性杂交瘤细胞株的建立
• 4.5.1 全病毒抗原间接ELISA方法
• 4.5.2 间接免疫荧光（IFA）
• 4.6 单克隆抗体的初步鉴定
• 4.6.1 杂交瘤细胞染色体计数
• 4.6.2 单克隆抗体的亚类鉴定
• 4.6.3 杂交瘤细胞稳定性测定结果
• 4.7 单克隆抗体大规模生产
• 4.7.1. 单克隆抗体腹水的制备
• 4.7.2. 腹水单克隆抗体的效价测定
• 4.7.3 单克隆抗体蛋白含量的测定
• 4.7.4 单克隆抗体的SDS-PAGE电泳
• 4.8 双抗体夹心ELISA方法的建立
• 4.8.1 单克隆抗体的标记
• 4.8.2 双抗体夹心ELISA方法抗体最佳包被抗体与酶标抗体配对的确定
• 4.8.3 双抗体夹心ELISA阴阳界限的确定
• 4.8.4 特异性试验
• 4.8.5 重复性试验
• 4.8.6 敏感性试验
• 4.8.7 新城疫病毒感染临床样品的检测
• 4.8.8 对新城疫病毒疫苗株和野毒株的检测
• 5. 讨论
• 5.1 制备抗原的重要性
• 5.2 免疫动物与抗体水平的检测
• 5.3 细胞融合
• 5.4 杂交瘤细胞的克隆及冻存复苏
• 5.5 杂交瘤细胞株建立过程污染控制
• 5.6 单克隆抗体特异性的鉴定
• 5.7 辣根过氧化物酶标记单克隆抗体
• 5.8 包被抗体和酶标抗体最佳配对的选择
• 5.9 封闭物的选择
• 5.10 临界值的确定
• 5.11 双抗体夹心ELISA方法的特异性、敏感性试验
• 6. 结论
• 参考文献
• 致谢