氨基葡萄糖硫酸盐和小檗胺诱导白血病K562细胞凋亡的实验研究

论文摘要

白血病是一类临床常见的造血系统恶性肿瘤，现代常规治疗方法的效果已达到一平台期，大部分患者由于不能耐受化疗药物的毒副作用或者因白血病细胞对化疗药物的耐药而导致治疗失败。目前诱导白血病细胞凋亡是治疗白血病的策略之一，因此寻找高效低毒的白血病细胞诱导剂显得尤为迫切。肿瘤凋亡机制的深入研究，将为治疗恶性肿瘤奠定良好的基础。氨基葡萄糖硫酸盐（glucosamine，GS）是氨基葡萄糖的一种重要衍生物，是人体内合成氨基粘性多糖、糖蛋白、糖脂等大分子的重要原料。最近实验研究揭示了GS一种新的生物学作用，研究曾发现氨基葡萄糖及其盐酸盐可诱导K562细胞向巨噬细胞方向分化，其硫酸盐可诱导K562细胞的凋亡。GS来源于自然生物，安全可靠，毒副作用小；具有比同类产品更高的生物利用度；具有很强的穿透力，能够迅速进入到细胞内部；但在血液系统肿瘤方面研究较少。有研究报道GS能够激活Caspase-3和下调Bcl-2蛋白水平，其诱导细胞凋亡的作用主要是通过线粒体途径，下调Bcl-2，改变跨膜电位，促进膜通透孔开放，激活Caspase-3而实现的。小檗胺（Berbamine，BBM）是从我国中草药小檗科（Berberis）植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，小檗胺及其衍生物均为钙调素拮抗剂（Calmodulin antagonist）。近来有研究发现，小檗胺不仅具有逆转白血病耐药的作用，而且也有明显的抗肿瘤作用。BBM对慢性粒细胞白血病急变期K562细胞、Imatini耐药的K562细胞及原代白血病细胞的生长均具有明显的抑制作用，并可诱导白血病细胞凋亡，但其作用分子机制仍不十分清楚。有研究报道BBM诱导K562细胞凋亡过程中出现的明显的Caspase-3表达水平增高。由于这两种药物在诱导K562细胞凋亡过程中具有一定的交叉点，所以我们选择这两种药物联合使用，探讨其诱导细胞凋亡的通路是否有相加性，从而能否进一步增强诱导K562细胞凋亡的作用。Survivin是新近发现的IAPs家族独特成员，Survivin基因定位于17q25染色体，在正常人的胎盘和胸腺组织中有微弱表达，在其他正常组织中几乎都检测不到。Survivin在近乎所有的常见恶性肿瘤组织及白血病中都有过量表达，其高表达常提示患者预后不良。Survivin能够抑制细胞凋亡、促进细胞增殖，并在细胞的有丝分裂中起重要作用。Survivin可抑制凋亡通路下游的Caspase-3和Caspase-7的酶原转变为有活性的Caspase-3和Caspase-7，从而发挥抗凋亡作用。因此以该基因为靶点，可为基因治疗白血病提供很好的途径。Caspases（cystein aspartate-specific proteases）是一组具有高度同源性，并且与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白酶，在细胞凋亡信号转导中具有重要作用。Caspases家族被发现至今其成员已超过14种，其中Caspase-3在很多正常细胞或者肿瘤细胞中均有表达，是Caspases瀑布式激活反应中重要的效应分子，可激活其他的Caspases，被称为“放大器”蛋白酶。因此Caspase-3是细胞凋亡过程中的激活的关键酶，也是细胞凋亡的主要效应分子，其活性的改变直接影响细胞凋亡产生。在细胞凋亡执行过程中，Caspase-3作为凋亡级联途径中的关键酶，可全部或者部分识别并水解相应底物蛋白。一旦被凋亡信号途径激活，Caspase-3能将细胞内相应蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。细胞色素C（cytochrome，Cyt c）是一种水溶性蛋白，位于线粒体内外膜之间，并与内膜松弛相连。Cyt c除参与细胞有氧呼吸活动外，在激活Caspases及诱导细胞凋亡方面具有重要意义。当其从线粒体位移至细胞质中并与凋亡活化因子-1（apoptotic protease-activating factor，Apaf-1）结合后，再与procaspase-9相互作用，形成凋亡复合体，从而激活Caspase-3，启动凋亡级联反应从而引发细胞凋亡。本研究中我们选择Survivin、Cyt c、Caspase-3这三种有紧密联系的蛋白作为研究GS和BBM联合用药诱导K562细胞凋亡的分子机制的基础。目的本实验旨在研究GS与BBM联合及单独用药诱导K562细胞凋亡的分子机制：首先分别检测不同浓度GS、BBM单独作用对K562细胞的增殖抑制率，得出二者单独作用的最佳有效浓度；然后将此二最佳有效浓度联合应用，观察其联合应用对细胞的凋亡诱导作用，为临床联合用药提供实验依据；检测两种药物单独以及联合应用诱导细胞凋亡的过程中Survivin、Caspase-3蛋白表达水平的变化以及胞浆中Cyt c蛋白含量的变化来探讨其诱导K562细胞凋亡的相关分子机制，并观察两者是否有协同促细胞凋亡效应。方法细胞培养，以不同剂量的药物处理慢性粒细胞白血病急变期K562细胞，倒置显微镜观察细胞形态学的变化并拍照；用细胞计数法计数细胞生长情况并描绘细胞生长曲线；MTT比色法检测细胞增殖抑制情况并计算增殖抑制率，找出两种药物单独作用的最佳有效浓度；并将此二最佳有效浓度联合应用再次检测细胞增殖抑制情况并计算增殖抑制率；取对数期生长期细胞，随机分为四组：对照组（未用药物处理的K562细胞）、实验1组（5.0mmol／L GS处理的K562细胞）、实验2组（10mg／L BBM处理的K562细胞）、实验3组（5.0mmol／LGS和10mg／L BBM联合处理的K562细胞）；流式细胞术（FCM）检测细胞早期凋亡率并检测Caspase-3、Survivin蛋白表达水平的变化；Western blot检测药物作用前后线粒体是否有Cyt c蛋白释放入胞浆的变化。结果MTT比色法结果显示5.0mmol／L GS与10mg／L BBM为抑制细胞增殖的最佳有效浓度，且实验3组对K562细胞增殖抑制作用明显增强。细胞凋亡率显示各实验组细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.01），在72h时实验3组细胞凋亡率明显增高为（71.09±1.24）％，联合用药呈现很强的协同增强效应。实验3组Caspase-3、Survivin蛋白的阳性表达率在72小时分别为（78.46±0.12）％、（8.24±0.45）％，前者明显高于对照组（7.56±1.33）％（P＜0.01）、而后者则明显低于对照组（38.24±0.14）％（P＜0.05）。Western blot结果显示72h实验3组细胞胞浆中Cyt c蛋白含量显著高于对照组和实验1、2组（P＜0.05）。结论1．GS、BBM单独及联合用药均可抑制K562细胞的增殖，且联合用药后对K562细胞的增殖抑制作用更为明显。2．检测细胞凋亡率发现，联合用药后K562细胞的早期凋亡率明显高于对照组及单独用药组，说明两者联合使用可以增强诱导K562细胞凋亡的作用，具有协同效应，且有一定的时间依赖性。3．实验过程中伴有胞浆Cyt c蛋白含量升高、Survivin蛋白表达的下调、Caspase-3蛋白表达的上调。4．二者单独用药对K562细胞的凋亡诱导作用主要是通过线粒体-Caspases途径，并推测联合用药后对细胞的凋亡诱导作用的增强是因为此途径的相加性。5．Survivin蛋白的减少可以在一定程度上缓解对Caspase-3的抑制作用，进一步增强诱导K562细胞凋亡作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 论文部分 氨基葡萄糖硫酸盐和小檗胺诱导白血病K662细胞凋亡的实验研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述部分 细胞色素C、Survivin和细胞凋亡
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢