新型调节性T细胞在强直性脊柱炎患者中的作用研究

论文摘要

目的：强直性脊柱炎是一种慢性自身免疫性疾病,调节性T细胞在其发生发展过程中发挥着重要作用。调节性T细胞在表型和功能上具有异质性,由于缺乏特异性标志,鉴定和分离有功能的调节性T细胞及其在AS发病中的作用仍存在较大争议。本研究中,我们发现通过CD39和CD45可进一步将CD4+CD25++细胞分成新型的调节性T细胞亚群,并测定了其在强直性脊柱炎患者中的功能。方法：采取正常人和患者外周血50-100ml,用流式细胞染色进行表型分析；分别用磁珠和流式分选出调节性T细胞各亚群,和效应T细胞共培养,氢3掺入法、CFSE法测定细胞增殖,ELISA测定培养上清IFN-g、IL17分泌。Real-time PCR测定Foxp3亚型。Micoarray测定基因表达谱。高通量测序TCR-beta CDR3,测定TCR受体库。结果：CD39和CD45RO可进一步将CD4+CD25++T细胞分成3个亚群（G1, G2,G3）。G1（CD39+CD45RO+CD4+CD25++）的Foxp3表达变异度大,TCR刺激后可以增殖并分泌大量炎性细胞因子,尤其是IL17。其Foxp3不稳定,TCR刺激后表达迅速下降,无抑制功能。G2（CD39+CD45RO+CD4+CD25++）为Foxp3hi,表型为效应型调节性T细胞,具有最强的抑制功能,TCR刺激后不能增殖并且很快凋亡。G3（CD39+CD45RO-CD4+CD25++）为Foxp3low,TCR刺激后可以增殖但无炎性细胞因子分泌,其抑制功能弱于G2细胞。此外,G3细胞在体外反复TCR刺激后可以在表型和功能上诱导扩增为G2细胞。所以通过CD39和CD45RO可以将Foxp3+Treg和Foxp3+Non-Treg（G1）清楚地区别开,并且将Foxp3+Treg分为effctor Treg（G2）和naive Treg（G3）.为进一步比较幼稚型调节性T细胞和效应型调节性T细胞在转录水平上的不同,我们通过microarray方法进一步比较了二者的基因表达谱,发现调节性T细胞功能性相关的蛋白分子在effector Treg中升高,并且effector Treg高表达和凋亡相关的分子,进一步提示调节性T细胞已经分化成熟。通过高通量测序TCR-beta CDR3,比较各亚群间TCR受体库的组成,发现naive Treg（G3）细胞的TCR谱很广,并且都是小克隆,没有优势克隆,并且和其他3群细胞没有克隆覆盖。Foxp3+Non-Treg（G1）和effector Treg（G2）有一定的克隆覆盖。他们和效应T细胞（Tresp）都有小部分克隆覆盖,且G1细胞多余G2。我们还测定了这3群细胞在AS患者中的数量和功能,和正常对照相比,3群细胞的数量无明显差异,但是其Foxp3的阳性率在AS患者中略低于正常人,尤其是naive Treg（G3）.在功能上,强直性脊柱炎患者Non-Treg （G1）可以分泌更多的炎性细胞因子IFN-g和IL17,而effctor Treg （G2）和naive Treg （G3）的抑制功能部分受损。结论：在CD4+CD25++的基础上,CD39结合CD45RO可以更精确地定义调节性T细胞亚群,这会测定调节性T细胞在强直性脊柱炎中的作用提供更可靠的表型鉴定。可以将naive Treg在体外扩增诱导为effector Treg,并且保持高效的抑制功能,为体外细胞治疗提供一个可能的策略。强直性脊柱炎患者中的调节性T细胞的数无明显异常,但是其功能受损,包括效应型调节性T细胞和幼稚型调节性T细胞。此外,我们还发现强直性脊柱炎患者外周血中Foxp3+Non-Treg过度活化,可以分泌更多的炎性细胞因子,这可能也参与了强直性脊柱炎的免疫功能紊乱。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一章 CD39+调节性T细胞的表型及功能
• 一、材料
• （一） 检测对象
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• （四） 主要溶液配制
• 二、方法和步骤
• （一） Ficoll密度梯度离心法分离外周血PBMC
• （二） 流式细胞术测外周血调节性T细胞亚型
• （三） 调节性T细胞抑制功能实验
• （四） 放射性氢三测细胞增殖
• （五） 双抗夹心法检测培养上清细胞因子含量
• （六） 统计学分析方法
• 三、结果
• （一） 在CD4+T细胞中,CD39表达和CD25表达正相关
• （二） CD39+CD4+CD25++和CD39-CD4+CD25++体外抑制功能比较
• 四、讨论
• 第二章 CD4+CD25++T细胞的亚型分析
• 一、材料
• （一） 检测对象
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、方法和步骤
• （一） Ficoll密度梯度离心法分离外周血PBMC
• （二） 流式细胞术测外周血调节性T细胞亚型
• （三） 荧光定量PCR检测各亚群表达Foxp3型mRNA水平
• （四） 统计学分析
• 三、结果
• （一） CD4+CD25++T细胞含有3个不同的亚群
• （二） 3个亚群表型分析
• （三） 3个亚群Foxp3型表达分析
• （四） 3个亚群增殖及分泌细胞因子情况分析
• 四、讨论
• 第三章 CD4+CD25++T细胞各亚群抑制功能分析
• 一、材料
• （一） 检测对象
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、方法和步骤
• （一） 调节性T细胞抑制功能实验
• （二） 统计学分析方法
• 三、结果
• （一） 3个亚群对效应T细胞抑制作用
• （二） 调节性T细胞（G2,G3）在抑制细胞增殖和细胞因子分泌的关系
• （三） 比较效应性调节性T细胞（G2）和幼稚型调节性T细胞（G3）
• 四、讨论
• 第四章 预活化Naive调节性T细胞可显著增强其抑制功能
• 一、材料
• （一） 检测对象
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、方法和步骤
• （一） 纯化细胞
• （二） 预活化G3细胞
• （三） 调节性T细胞抑制功能实验
• （四） 统计学分析方法
• 三、结果
• （一） 预活化后G3细胞表型变化
• （二） 活化后G3的抑制功能测定
• 四、讨论
• 第五章 将Naive调节性T细胞在体外扩增转化为效应调节性T细胞
• 一、材料
• （一） 检测对象
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、方法和步骤
• （一） 纯化细胞
• （二） 体外诱导扩增调节性T细胞
• （三） 调节性T细胞抑制功能实验
• （四） 重复刺激括增后的G3细胞表型测定
• （五） 统计学分析方法
• 三、结果
• （一） 重复刺激后表型变化
• （二） 诱导扩增后的抑制功能
• 四、讨论
• 第六章 幼稚型和效应型调节性T细胞基因表达谱
• 一、材料
• （一） 检测对象
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、方法和步骤
• （一） 纯化细胞
• （二） 细胞总RNA抽提及质检
• （三） Affymetric GeneChip Analysis
• （四） 分析方法
• 三、结果
• （一） G2、G3、Tresp细胞群PCA分析
• （二） G2、G3、Tresp细胞群基因表达谱热力图分析
• （三） G2、G3、Tresp细胞群主要差异基因热力图分析
• （四） G2、G3、Tresp细胞群主要差异基因分析
• （五） G2、G3细胞群主要差异基因信号通路分析
• 四、讨论
• 第七章 调节性T细胞TCR受体库高通量测序分析
• 一、材料
• （一） 检测对象
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• （四） 主要溶液配置
• 二、方法和步骤
• （一） 纯化细胞
• （二） 细胞总RNA抽提及质检
• （三） cDNA合成及TCRbeta谱测序
• （四） 分析方法
• 三、结果
• （一） 比较同一样本克隆的重复性
• （二） G1、G2、G3和Tresp细胞TCR beta CDR3核酸序列表达及相互关系
• （三） G1、G2、G3和Tresp细胞TCR beta CDR3氨基酸表达及相互关系
• （四） G1、G2、G3和Tresp细胞TCR beta CDR3表达谱
• （五） G1、G2、G3和Tresp间克隆覆盖率比较
• 四、讨论
• 第八章 强直性脊柱炎患者调节性T细胞的比例和功能测定
• 一、材料
• （一） 检测对象
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、方法和步骤
• （一） 流式细胞术测定调节性T细胞比例
• （二） AS患者中CD4+CD25++各亚群功能测定
• （三） 统计学分析方法
• 三、结果
• （一） CD4+CD25++各亚群比例测定
• （二） G1细胞的在AS患者中的表型和功能测定
• （三） G2细胞在AS患者中的功能测定
• （四） G3细胞在AS患者中的功能测定
• （五） 比较G2、G3抑制功能的相关性
• 四、讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 在读期间发表论文及参加科研情况
• 致谢