转录因子Nanog的表达导致HEK-293细胞发生恶性转化及相关机制的研究

论文摘要

Nanog是近些年来发现的一个重要转录因子,对维持胚胎干细胞的自我更新和多向分化潜能具有重要作用。最初人们认为Nanog只在胚胎干细胞、胚胎生殖细胞及胚胎癌细胞等多能性细胞中表达,在正常成体组织中不表达。而最近的研究发现Nanog在包括精原细胞瘤、乳腺癌、视网膜母细胞瘤和前列腺癌细胞都存在表达,提示Nanog可能在肿瘤细胞中存在普遍表达。最新的研究表明,Nanog在造血干细胞中的表达导致了肿瘤的发生,提示Nanog可能是癌基因,并导致细胞发生转化。为了确认Nanog在肿瘤细胞中表达的普遍性,我们通过RT-PCR和Western-blot检测了多种肿瘤细胞系,结果发现都存在Nanog的高表达。为了鉴定Nanog是否是癌基因,我们进行了一系列的实验。首先,我们通过RT-PCR的方法,在表达Nanog的人畸胎瘤细胞PA-1中扩增得到Nanog基因,构建载体pcDNA3.1（+）-Nanog并转染HEK-293细胞,通过G418筛选得到稳定表达Nanog的293-N细胞;对照组293-C是空载体转染293细胞而获得。随机选取一株阳性细胞克隆和对照细胞克隆,分别命名为293-N1和293-C1,通过RT-PCR和Western-blot验证Nanog的表达。接下来,我们进行了MTT比色实验、软琼脂集落形成实验以及裸鼠成瘤实验,通过实验我们发现Nanog的表达使细胞生长速率加快,获得软琼脂克隆形成能力,并在注射裸鼠后成瘤。对肿瘤组织切片H.E.染色分析发现,肿瘤细胞分化程度低,并有侵润到其它组织的现象;说明肿瘤的恶性程度高,并且发生了侵袭和转移。为了进一步研究Nanog表达的致瘤机制,我们对293-N1和293-C1细胞进行了蛋白质组学分析。我们首先通过软件分析确定了293细胞全蛋白大致的分布范围,最终确定采用pH4-7的胶条进行实验。通过多次实验获得了4对平行性很好的双向电泳胶图,经软件分析最终确定33个蛋白差异点,选出29个点进行MALDI-TOF质谱测定鉴定出25个蛋白点,其中发现2个与肿瘤密切相关的蛋白FAK和Ezrin表达上调。半定量RT-PCR和Western-blot实验证明,这两种蛋白确实发生了表达上调。许多研究都表明,FAK和Ezrin与癌症的增殖、存活和转移密切相关,因此FAK和Ezrin的表达上调很可能是293细胞发生恶性转化的主要原因之一。另外,我们还发现293细胞中Nanog的表达导致转录因子Nac1的表达升高。进一步通过免疫共沉淀和GST pull-down实验证明,Nanog和Nac1在体内和体外都存在相互作用。由于Nac1和Nanog一样,是维持胚胎干细胞自我更新和多能性的重要转录因子,因而为我们揭示Nanog介导的293细胞的恶性转化提供了线索。综上所述,本研究发现Nanog的表达可以使正常细胞发生恶性转化。采用蛋白质组学的方法分析Nanog介导的恶性转化机制,发现FAK和Ezrin的表达上调很可能导致了癌变的发生。Nac1的表达上调及与Nanog的相互作用,也很可能有助于这一过程的发生。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 Nanog概述
• 1.2 Nanog的表达调控及与外源因子的关系
• 1.3 Nanog与ES细胞中主要的转录调控网络
• 1.4 Nanog与ES细胞中主要的蛋白相互作用网络
• 1.5 Nanog与核重编程
• 1.6 Nanog与肿瘤
• 1.7 本研究的目的及主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 第3章 结果
• 3.1 预实验：Nanog在多种肿瘤细胞中的表达
• 3.2 表达Nanog使人正常细胞HEK-293 发生恶性转变
• 3.3 接种293-N1 细胞导致裸鼠形成肿瘤及肿瘤切片分析
• 3.4 293 细胞表达Nanog的蛋白质组学分析
• 第4章 讨论
• 4.1 Nanog使293 细胞发生恶性转化
• 4.2 Nanog的表达导致FAK和Ezrin蛋白表达上调
• 4.3 与肿瘤相关的其它蛋白
• 4.4 Nanog和Nac1 的相互作用与肿瘤发生
• 4.5 问题与展望
• 结论
• 参考文献
• 附录 MALDI-TOF-MS鉴定结果
• 在读期间发表论文
• 致谢