淡水环境中含有PR基因的细菌的分离鉴定

论文摘要

变形菌视紫红质（Proteorhodopsin PR）是一类吸光色素膜蛋白,它是由7个跨膜α-螺旋（A-G）组成的视蛋白（opsins）与色素视黄醛（retinal）通过共价键结合而形成的。PR首先在海洋细菌中被发现,在随后的研究中发现,PR广泛的分布于各种淡水和海水水域中。而目前,尽管科学家们已在海洋及淡水水域通过宏基因组测序发现了超过10,000种PR的基因,但是对于PR宿主菌的分离及研究比较少,尤其是淡水中的PR宿主菌还未见报道。为了能够更好地研究PR及其在细菌体内的功能,我们试图在淡水中筛选含有PR的细菌。为了能够在淡水中快速有效的获得含有PR基因的细菌,我们构建了一个缺失编码300bp左右PR保守序列的表达载体pHot75BE-vc,并验证了利用该载体进行PR基因的鉴定的可行性。结果表明,利用该载体可以正确表达已知PR蛋白,该载体可以用于快速筛选含有PR基因的细菌。本实验随后利用构建的载体pHot75BE-vc对采集的不同水样进行含PR基因的细菌的筛选。成功地从金牛湖采集的水样中分离出一株含有PR基因的菌株命名为JL-3。扩增出的300bp保守序列的测序结果经与同源PR的氨基酸序列对比表明,其与Exiguobacterium sibiricum255-15中rhodopsin中81位到195位的氨基酸序列有86%的同源性。为了获得该PR的全基因,根据已获得的300bp的PR基因序列,采用Self-Formed Adaptor PCR的方法,成功地扩增得到了该菌的全长为750bp的PR基因。本实验还对分离得到的JL-3进行了分类鉴定,通过对形态学、生理生化特性和16srDNA的序列分析,结果显示,该菌属于微小杆菌属（Exiguobacterium）.因此将其命名为Exiguobacterium sp.JL-3.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 引言
• 文献综述
• 一、视紫红质（rhodopsin）与变形菌视紫红质（Proteorhodopsin）
• 1. 视紫红质的简介
• 2. 变形菌视紫红质（Proteorhodopsin）及其发现
• 3. 变形菌视紫红质（Proteorhodopsin）的分类
• 二、变形菌视紫红质（Proteorhodopsin）的生态分布及多样性
• 1. PR的生态分布
• 2. PR的生物多样性
• 3. 不同光谱型的PR及其分布情况
• 三、变形菌视紫红质（Proteorhodopsin）的功能
• 1. PR的质子泵功能及其对宿主菌的作用
• 2. Proteorhodopsin的生态学意义
• 第1章 用于筛选PR基因的载体的构建和验证
• 摘要
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 质粒及宿主菌
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 酶和试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 pHot75BE-vc载体的构建
• 1.2.2 pHot75BE-vc载体的应用可行性验证
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 PR蛋白序列比对
• 1.3.2 载体pHot75BE的构建
• 1.3.3 载体pHot75BE-vc的构建
• 1.3.4 载体pHot75BE-vc的验证
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2章 淡水环境中含有PR基因的细菌的筛选
• 摘要
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 水样的来源
• 2.1.2 质粒和宿主菌
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂和及相关仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细菌的富集
• 2.2.2 含有PR基因细菌的分离
• 2.2.3 目的基因的鉴定
• 2.2.4 含有目的基因的重组质粒的测序鉴定
• 2.2.5 JL-3菌的PR基因的获得及序列分析
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 供试水样的来源
• 2.3.2 水样的富集
• 2.3.3 含有PR基因细菌的分离
• 2.3.4 重组质粒pHot75BE-JL-3的测序结果
• 2.3.5 JL-3的PR全序列的扩增及序列测定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 JL-3菌的分类地位的确定
• 摘要
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 供试材料的来源的菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌落及菌体形态观察
• 3.2.2 菌株JL-3生长曲线的测定
• 3.2.3 生理生化特性
• 3.2.4 质子泵功能的测定
• 3.2.5 菌株JL-3的趋光性实验
• 3.2.6 在温度为25℃时光照对菌株生长情况影响测定
• 3.2.7 在分子水平上JL-3的分类地位的鉴定
• 3.3 实验结果和分析
• 3.3.1 菌落及菌体形态特征
• 3.3.2 生长曲线的测定
• 3.3.3 生理生化特性
• 3.3.4 JL-3质子泵功能的测定
• 3.3.5 JL-3的趋光性实验
• 3.3.6 在温度为25℃时光照对菌株生长情况影响测定
• 3.3.7 在分子水平上JL-3的分类地位的鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 全文总结
• 研究的主要创新点
• 参考文献
• 附录一
• 附录二 有关核苷酸序列
• 致谢