纳米纤维薄膜对人脐静脉内皮细胞生长行为的影响研究

论文摘要

细胞生长支架是组织工程和再生医学研究领域的一个重要方面,它为细胞的生长和组织的重建与再生提供人造的微环境。因此,如何构建结构上更合理更适用的支架以及如何提高支架的生物相容性是一直以来相关领域中研究的热点和难点。天然细胞外基质分布于细胞外空间,是由细胞分泌的蛋白和多糖所构成的纤维网络结构,对细胞的迁移、增殖和分化等有重要的调控作用。近年来,具有三维结构的纳米纤维支架因其更接近天然的细胞生长微环境而逐渐地受到研究者越来越多的关注。纳米纤维支架的制备方法主要有自组装、相分离和高压静电纺丝。其中高压静电纺丝技术操作简单,可控性强,能够以不同聚合物为原料,制备出连续的、不同取向、不同力学性质的纳米级或亚微米级超细纤维,显示了在仿生天然细胞外基质方面的独特优势。在用于制备纳米纤维支架的生物材料方面,研究者也进行了诸多的尝试,以便制备出具有更高生物相容性的支架。迄今已有多种材料通过电纺丝技术制备成细胞薄膜,主要包括以下几类:天然材料、合成高分子材料、以及复合材料。其中合成高分子材料由于其来源方便,机械性能好,重复性高而成为组织工程研究中纳米纤维薄膜的主要材料,但其组织相容性低于天然材料,缺乏细胞刺激信号。无机/有机复合材料结合了高分子无机材料良好的机械性能和有机材料生物相容性。成为组织工程支架材料的研究热点。碳元素是地球上一切生物有机体的骨架元素组成,具有相对稳定的物理特性以及良好生物相容性。碳纳米管作为一种纳米尺度的新型炭材料,具有的独特空心管状结构和优异的传导性能和力学强度,并且对多种蛋白质分子都有较强的吸附。本课题通过溶液共沉淀方法制备了聚氨酯（PU）与多壁碳纳米管（MWNT）的复合材料（MWNT/PU）,采用高压静电纺丝技术构建了PU、MWNT/PU的取向纳米纤维薄膜和无纺纳米纤维薄膜。选用离体时间短、性状与体内相似的人脐静脉内皮原代培养细胞为实验细胞,研究了上述两种化学组成的纳米纤维薄膜对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生长的引导作用和可能的作用机理。主要研究内容包括:选择优化的控制参数制备电纺丝纳米纤维薄膜,通过扫描电子显微镜对取向纳米纤维薄膜的形貌进行观察;通过MTS试剂盒检测细胞在薄膜上的增殖情况,研究取向纳米纤维薄膜对HUVEC生长的促进作用;通过扫描电子显微镜观察内皮细胞在薄膜上生长的形态;通过激光扫描共聚焦显微镜,观察细胞骨架中肌动蛋白、微管蛋白及纽蛋白纤维的形成情况。此外,通过ELISA方法检测了生长在不同薄膜上的HUVEC分泌组织因子（TF）、浆纤溶酶原激活抑制剂-1（PAI-1）、一氧化氮（NO）的释放量,探讨了纳米纤维结构对HUVEC抗凝血功能的影响;检测了HUVEC细胞在薄膜上生长时Ⅳ型胶原的合成量,探讨了纳米纤维结构对细胞外基质重建的作用。在上述研究的基础上,通过在培养基中添加MEK1/2化学抑制剂U0126观察细胞骨架的形成,探讨了取向纳米纤维薄膜对细胞迁移、骨架发育的影响及可能的信号转导通路。实验结果表明,应用高压静电纺丝技术所制备的取向纳米纤维薄膜具有良好取向,其中的纤维直径为300 nm-500 nm;细胞实验证实,取向纳米纤维薄膜可明显促进HUVEC增殖;在取向纳米纤维薄膜上生长的内皮细胞呈抗凝血表型,此外,与光滑平膜和无规纳米纤维薄膜相比,取向纳米纤维薄膜可以显著促进细胞外基质的合成。细胞骨架观察显示,HUVEC在取向纳米纤维薄膜上沿纺丝方向定向排列生长,且纳米纤维薄膜支持细胞的长时间生长。MEK1/2化学抑制剂U0126对细胞骨架的影响结果显示,细胞对纳米纤维结构底感受可能通过MAPK途径进行信号的放大转导,从而引起细胞的迁移等一系列生物响应。此外纳米纤维的取向和碳纳米管的加入均有利于在薄膜上生长的细胞分泌细胞外基质蛋白,如胶原蛋白,有利于外基质的重建,进而为细胞提供更“友好”的生存环境。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 纳米纤维薄膜的制备方法概述
• 1.3 高压静电纺丝技术
• 1.4 纳米纤维结构对细胞行为的影响
• 1.5 探索纳微米结构对细胞行为影响的分子机制的方法
• 1.6 纳米纤维用生物材料
• 1.7 本论文的研究思路
• 第二章 实验方法和技术路线
• 2.1 主要材料和试剂
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 生物材料样品的制备与处理
• 2.4 电纺薄膜的微观结构表征
• 2.5 人原代脐静脉内皮（HUVEC）细胞培养
• 2.6 细胞增殖实验
• 2.7 细胞形态观察
• 2.8 细胞功能检测
• 2.9 定向纳米纤维诱导细胞生长的信号通路研究
• 2.10 统计分析
• 第三章 结果
• 3.1 高压静电纺丝制备纳米纤维薄膜的形貌和微观结构分析
• 3.2 取向纳米纤维薄膜对内皮细胞增殖的影响
• 3.3 纳米纤维薄膜对内皮细胞骨架发育的影响
• 3.4 纳米纤维结构对组织因子释放量的影响
• 3.5 纳米纤维结构对纤溶酶原激活抑制剂-1释放量的影响
• 3.6 纳米纤维结构对Ⅳ型胶原的合成与分泌的影响
• 3.7 纳米纤维结构一氧化氮释放量的影响
• 3.8 纳米纤维薄膜对内皮细胞生长行为的调控作用
• 第四章 讨论
• 4.1 天然细胞外基质的构成及利用纳米技术构建仿生细胞外基质
• 4.2 纳米纤维结构对内皮细胞骨架发育及形态的影响及分析
• 4.3 纳米纤维薄膜对于内皮细胞抗凝血功能的影响
• 4.4 纳米纤维薄膜对于内皮细胞细胞外基质重建的影响及意义
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1:论文中缩略语词汇及词义解释表
• 附录2:硕士研究生期间发表的文章和参加会议情况
• 附录3:非论文综述