利用RNase Ⅲ缺陷型菌株发酵hpRNA防治烟草花叶病毒

论文摘要

本研究依据RNAi机制,以TMV外壳蛋白基因序列为模板,构建含反向重复片段的表达载体,进而转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌（DY330）中,得到可以表达hpRNA的工程菌,发酵工程菌提取hpRNA后喷洒烟叶以抵抗TMV。试验主要内容包括:1、构建表达hpRNA的工程菌DY-hp根据TMV外壳蛋白基因序列设计引物,提取烟叶总RNA、反转录、PCR获得cDNA,测序比对结果显示相似性为98.33%。以cDNA为模板,扩增大、小两片段,将与T载体相连,得到含反向重复片段的克隆载体,测序比对结果显示一致性为99.73%。将反向重复结构与表达载体pET-21a相连后转化RNaseⅢ缺陷型菌株（DY330）得到表达hpRNA的工程菌DY-hp。2、菌株DY-hp发酵hpRNA的条件优化测定了DY-hp的生长曲线,发现IPTG诱导4小时后hpRNA产量最高,又对IPTG诱导浓度和诱导菌浓进行了优化,结果是当OD600值为0.4、IPTG为0.4mM时hpRNA产量最大,此时每毫升发酵液得到约23μg hpRNA。3、喷洒hpRNA处理烟叶实验一共六个处理:接种TMV三天前喷洒hpRNA、接种TMV三天后喷洒hpRNA、接种TMV并喷洒含空载体菌株DY-control发酵提取物、只接种TMV、只喷洒hpRNA、空白对照,实验重复三次,hpRNA预防TMV的处理抗病率达到65%,治疗TMV的处理抗病率为40%。本研究创新性采用一步单酶切、一步酶连高效、便捷的得到了同源于TMV外壳蛋白基因序列的反向重复结构,最终成功得到了高效表达hpRNA的工程菌DY-hp,并对DY-hp发酵进行了简单优化,最后通过hpRNA喷洒烟苗处理证实hpRNA达到65%抗TMV的预防效果。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 烟草普通花叶病毒
• 1.1.1 烟草普通花叶病毒的发现
• 1.1.2 烟草普通花叶病毒的分子学特征
• 1.1.3 烟草普通花叶病毒的生物学特征
• 1.2 传统手段防治烟草花叶病
• 1.2.1 烟草抗花叶病品种的选育
• 1.2.2 农业防治
• 1.2.3 化学防治
• 1.2.4 生物防治
• 1.2.5 天然抗病毒物质防治
• 1.3 基因工程技术防治烟草花叶病
• 1.3.1 病毒外壳蛋白基因介导的抗性（CPMR）
• 1.3.2 病毒复制酶基因介导的抗性
• 1.3.3 病毒卫星RNA 的利用
• 1.3.4 反义RNA 介导的抗病毒特性
• 1.4 RNAi 技术防治烟草花叶病
• 1.4.1 RNAi 的发现
• 1.4.2 RNAi 的机制
• 1.4.3 RNAi 的特征
• 1.4.4 利用RNAi 技术的策略
• 1.4.4.1 化学合成法
• 1.4.4.2 体外转录法
• 1.4.4.3 传统的以酶切、酶连为基础的RNA 干扰载体构建方法
• 1.4.4.4 以同源重组为基础的植物RNA 干扰表达载体构建方法
• 1.4.4.5 以重组PCR 技术为基础结合酶切、酶连的RNA 干扰载体构建方法
• 第二章 构建表达hpRNA 的工程菌DY-hp
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂耗材
• 2.1.2 仪器
• 2.2 实验内容
• 2.2.1 TMV 外壳蛋白基因的获得
• 2.2.1.1 烟叶总RNA 的提取
• 2.2.1.2 引物设计
• 2.2.1.3 反转录、PCR
• 2.2.1.4 添加酶连体系
• 2.2.1.5 酶连产物转化感受态细胞（DH5α）
• 2.2.1.6 挑取转化子于液体LB 培养后提取质粒、电泳检测并测序
• 2.2.2 构建克隆载体pMD19-EH
• 2.2.2.1 引物设计
• 2.2.2.2 扩增EK326、HK429 片段
• 2.2.2.3 KpnⅠ分别单酶切EK326、HK429
• 2.2.2.4 回收EK326（-）、HK429（-）
• 2.2.2.5 添加EK326（-）、HK429（-）、pMD19-T simple 共同酶连体系
• 2.2.2.6 酶连产物转化感受态细胞（DH5α）
• 2.2.2.7 挑取转化子于液体LB 培养后提取质粒、电泳检测并测序
• 2.2.2.8 酶切验证pMD19-EH
• 2.2.3 构建表达载体pET21-EH
• 2.2.3.1 回收EH（--）
• 2.2.3.2 回收pET21（--）
• 2.2.3.3 添加EH（--）、pET21（--）酶连体系
• 2.2.3.4 酶连产物转化感受态细胞（DH5α）
• 2.2.3.5 挑取转化子于液体LB 培养后提取质粒、电泳检测
• 2.2.3.6 酶切验证pET21-EH
• 2.2.4 获得表达hpRNA 的工程菌株DY-hp
• 2.2.4.1 制备DY330 感受态细胞
• 2.2.4.2 pET21-EH 转化DY330 感受态细胞
• 2.2.4.3 挑取转化子于液体培养后提取质粒、电泳检测
• 2.2.4.4 利用DY-hp 发酵并提取hpRNA
• 2.2.4.5 DNAaseⅠ、RNase A 酶切验证hpRNA
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 TMV 外壳蛋白基因的获得
• 2.3.1.1 烟草总RNA 的检测
• 2.3.1.2 RT-PCR 产物检测
• 2.3.1.3 质粒检测、cDNA 测序
• 2.3.2 构建克隆载体pMD19-EH
• 2.3.2.1 引物设计
• 2.3.2.2 PCR 产物EK326、HK429 的检测
• 2.3.2.3 EK326（-）、HK429（-）的检测
• 2.3.2.4 克隆载体pMD19-EH 的检测及酶切验证
• 2.3.2.5 克隆载体pMD19-EH 测序结果
• 2.3.3 构建表达载体pET21-EH
• 2.3.3.1 EH（--）检测
• 2.3.3.2 pET21（--）的检测
• 2.3.3.3 表达载体pET21-EH 酶切验证
• 2.3.4 获得表达hpRNA 的工程菌株DY-hp
• 2.3.4.1 工程菌株DY-hp 的获得
• 2.3.4.2 hpRNA 的检测和酶切验证
• 第三章 菌株DY-hp 发酵hpRNA 的条件优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂耗材
• 3.1.2 仪器
• 3.2 实验内容
• 3.2.1 DY-hp 生长曲线的测定
• 3.2.2 IPTG 诱导浓度的优化
• 3.2.3 诱导菌浓的优化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 DY-hp 生长曲线的测定
• 3.3.2 IPTG 最佳诱导浓度
• 3.3.3 最佳诱导菌浓
• 第四章 喷洒hpRNA 处理烟叶
• 4.1 材料
• 4.1.1 试剂耗材
• 4.1.2 仪器
• 4.2 实验内容
• 4.2.1 聚乙二醇提取TMV 颗粒
• 4.2.2 发酵、提取并喷洒hpRNA
• 4.2.3 接种TMV
• 4.2.4 Elisa 检测TMV 病毒
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 聚乙二醇提取TMV 颗粒
• 4.3.2 hpRNA 防治TMV 结果统计
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.1.1 TMV 外壳蛋白cDNA 序列的获得
• 5.1.2 表达hpRNA 反向重复序列结构的构建
• 5.1.3 工程菌DY-hp 发酵hpRNA 的条件优化
• 5.1.4 喷洒hpRNA 处理烟叶
• 5.2 讨论
• 5.2.1 构建反向重复序列结构方法的通用性
• 5.2.2 hpRNA 的大规模生产应用
• 5.2.3 hpRNA 干扰TMV 的效率
• 参考文献
• ABSTRACT