论文摘要
目的探索华蟾素中主要成分bufalin（蟾毒灵）对肝癌细胞放射增敏作用及其相关机制。方法1. WST-8 （water-soluble terazoliun salt）法测定bufalin对人肝癌细胞株PLC/PRF/5、HepG2、smmc7721以及sk-hepl的细胞毒性作用,并绘制细胞毒性曲线。2.采用cell clonogenic survival assay（细胞克隆形成实验）,检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5、HepG2、smmc7721以及sk-hepl放射后细胞存活以及bufalin放射增敏情况。3.采用FCM（流式细胞术）中DNA含量测定染色方法,检测肝癌细胞放射前后细胞周期变化。4.采用Western Blot（蛋白质印迹）实验检测肝癌细胞放射前后MAPK信号通路、STAT3信号通路、NFκB信号通路中蛋白表达情况。结果1.四株肝癌细胞在应用Bufalin后均出现生长抑制现象,PLC/PRF/5.HepG2. smmc7721以及sk-hepl在bufalin作用24h后的1C50分别为25.40nM,122.30nM,70.38nM和34.76nM,体外抑瘤曲线表明四株肝癌细胞中PLC/PRF/5对bufalin最为敏感,而HepG2最不敏感。2.细胞克隆形成实验表明PLC/PRF/5、HepG2、smmc7721以及sk-hepl对X射线的抵抗性不同,其中HepG2对X射线抵抗性最强,其次是PLC/PRF/5,再次是smmc7721,而sk-hepl对射线抵抗性最弱；放射前24h给予bufalin 50nM后对PLC/PRF/5、HepG2、smmc7721、sk-hep1等四株肝癌细胞均产生放射增敏作用,其放射增敏比SER （Do）分别是1.041、1.255、1.462和1.298。3.流式细胞术研究发现bufalin+放射组与单纯放射组相比,在放射前两组的细胞周期并未存在较大差异,但是bufalin+放射组中细胞凋亡率高于单纯放射组；放射后bufalin+放射组和单纯放射组细胞周期均发生变化,bufalin+放射组与单纯放射组相比明显将细胞阻滞于G2／M期。4.应用Western Blot检测在肝癌细胞放射前后ERK1/2、JNK、p38、STAT3、NFκB、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、p-STAT3以及D-NFκB蛋白变化情况,我们发现放射后单纯放射组总p-STAT3含量逐渐升高,但是bufalin+放射组p-STAT3蛋白表达水平受到抑制；通过检测STAT3上游激酶p-JAK1、p-JAK2以及p-Src在放射前后激活情况,发现单纯放射组中仅有p-JAK2激酶在受到X射线后磷酸化水平升高,而bufalin+放射组中p-JAK2激酶在受到照射后的激活情况受到抑制。放射前给予JAK2/STAT3信号通路抑制剂SD-1008后,我们发现SD-1008也明显抑制了放射后p-JAK2、p-STAT3的激活,细胞克隆形成实验表明SD-1008同样能对肝癌细胞产生放射增敏作用。结论1. Bufalin能增强肝癌细胞的放射敏感性。2.Bufalin对肝癌细胞放射增敏作用可能是通过改变放射后细胞周期,并将其阻滞于G2/M期有关；同时其增敏机制是通过阻断JAK2/STAT3信号通路从而增加对肝癌细胞的放射敏感性。
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