乳酸克鲁维酵母Cu，Zn-SOD基因在酿酒酵母中的表达

论文摘要

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase; EC 1.15.1.1; SOD）广泛存在于生物体内。按金属辅基的不同可分为Cu,Zn-SOD, Mn-SOD与Fe-SOD。Cu,Zn-SOD主要存在于真核生物的细胞质和过氧化物酶中,同时它也存在于植物的叶绿体中。在哺乳动物体内存在两种类型的Cu,Zn-SOD,一种是细胞内存在形式,叫细胞内Cu,Zn-SOD（简称Cu,Zn-SOD）,另一种是细胞外存在形式,叫细胞外Cu,Zn-SOD（简称EC-SOD）。SOD是机体内唯一以超氧阴离子自由基（O2-·）为底物的酶,它能专一地催化O2-·的歧化反应,生成过氧化氢和氧气,在防止氧化胁迫方面发挥重要作用,能有效的抵御氧自由基和其他氧化物,对机体防御氧化损伤起着十分重要的作用。本工作主要对SOD在抵抗外界胁迫下功能进行研究。通过PCR扩增技术从乳酸克鲁维酵母基因组中得到了465bp的Cu,Zn-SOD结构基因,从pUCm-T载体上获得了1214bp带有PGK1启动子和AT终止子的GFP基因,并把它们构建到酿酒酵母表达载体YEplac195-PSGA中。通过菌落PCR验证和荧光检测证明了所构建载体能在酿酒酵母中成功表达;通过百草枯压力筛选和邻苯三酚酶活测定法证明了乳酸克鲁维酵母SOD基因已经在酿酒酵母中表达并且提高了酿酒酵母在氧化胁迫方面的耐受力;也证明提高SOD的表达量只能在一定范围内增加菌体在氧胁迫方面的耐受力。通过SphⅠ/EcoRⅠ双酶切YEplac195-PSGA得到了PGK1-SOD-GFP-AT基因片段并插入YCplac33载体,得到了YCplac33-PSGA载体;通过荧光观察和热击实验得出含有YEplac195-PSGA载体的酿酒酵母SOD的表达量显著高于含有YCplac33-PSGA载体的酵母菌,抗热击能力也强于含有YCplac33-PSGA载体的酵母,从而证实SOD在防止氧化胁迫方面发挥了重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 SOD的发现
• 1.2 SOD的种类及分布
• 1.3 生物体内氧自由基的产生及其清除系统
• 1.3.1 自由基
• 1.3.2 氧与自由基
• 1.3.3 氧自由基产生的原因
• 1.3.4 机体内氧自由基的清除
• 1.3.5 SOD在维持氧自由基平衡中的作用
• 1.4 SOD基因的克隆及表达
• 1.4.1 SOD基因工程研究
• 1.4.2 酵母作为外源基因表达系统的研究进展
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒、菌株和引物
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 酵母基因组DNA的快速分离
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.3 DNA的限制酶消化
• 2.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 从琼脂糖中回收DNA
• 2.2.6 DNA的连接反应
• 2.2.7 PCR扩增反应
• 2.2.8 酵母细胞的转化方法
• 2.2.9 一步基因置换法缺失目的基因
• 2.2.10 SOD酶活力的测定方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 出发菌株营养缺陷型的构建
• 3.1.1 质粒pUC18-ura3 构建
• 3.1.2 ura3 菌株的构建
• 3.2 SOD表达菌株的构建
• 3.2.1 YEplac195-PGA载体的构建
• 3.2.2 YEplac195-PSGA载体的构建
• 3.2.3 YEplac195-PSGA载体的在LN1中的表达
• 3.3 转基因菌株生长特性
• 3.3.1 生长曲线的绘制
• 3.3.2 不同发酵条件下 SOD酶活性的测定
• 3.4 SOD在菌株热激反应中功能的研究
• 3.4.1 YCplac33-PSGA载体的构建
• 3.4.2 SOD在不同载体下的表达比较
• 3.4.3 SOD酶在菌株菌株热激反应中功能的研究
• 第四章 结论
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢