星状孢菌素在近紫外线辐射时对兔晶状体上皮细胞通讯功能的保护作用及其机制

论文摘要

目的近年来晶状体缝隙连接介到的胞间通讯（Gap junction intercellular communication,GJIC）异常已经作为白内障的重要病因而逐渐受到重视。缝隙连接是存在于相邻细胞间,由缝隙连接蛋白（Connexin, Cx）六聚体组成的细胞间连接,它是细胞间无机离子、水溶性小分子、代谢产物和电化学交流的直接通道。流行病学证据表明,长期慢性的紫外线,尤其是波长为320nm-40nm的长波紫外线,又称近紫外线,主要由晶状体吸收,因此近紫外线的辐射与年龄相关性白内障的发生可能有非常密切的关系,但机制尚未完全明确,有学者通过研究已经证实近紫外线、微波辐射[1]等相关理化因素可以导致晶状体发生混浊。本研究中,我们引入蛋白激酶C （Protein kinase C, PKC）抑制剂星状孢菌素（Staurosporine, ST）,旨在探讨近紫外线辐射损伤时,星状孢菌素是否对晶状体上皮细胞通讯功能有保护作用,以期进一步证实近紫外线辐射引发白内障,系通过激活PKC途径引起GJIC功能下降所致,从而深入探讨近紫外线辐射导致白内障发病的机制,为以后白内障的药物防治提供一条新的线索。方法1.兔晶状体上皮细胞的原代培养及设立实验分组:健康成年无眼疾家兔静脉空气栓塞处死后,取出眼球后消毒,截取前囊膜修剪成数片,I型胶原酶消化后接种,10-12 h后第一次换液,后每2 d换液,7-10 d晶体细胞可长满大部分瓶底,并行传代,取第2-3代细胞用于实验研究。预实验选取星状孢菌素的合适药物浓度,确定近紫外线光源的辐射能量,设立正常组,实验组和对照组。2.晶状体上皮细胞通讯功能的评定:应用激光共聚焦显微镜,通过荧光光漂白恢复技术,分别检测正常组,实验组和对照组的晶状体上皮细胞的荧光恢复率,以评定细胞通讯功能状态。3.缝隙连接蛋白Cx43表达的检测:应用Western-blot方法,从翻译水平检测各个组Cx43蛋白表达情况。4.缝隙连接蛋白Cx43定位的检测:采用细胞间接免疫荧光化学技术,对晶状体上皮细胞Cx43蛋白进行定位分析。结果1.星状孢菌素实验浓度的确定为10-7mol/L:预实验中选取了5个浓度分别作用于的晶状体上皮细胞后,置于倒置致显微镜下观察,并行台盼蓝染色阳性细胞计数,高浓度10-4mol/L星状孢菌素可以迅速诱导细胞10分钟内大量死亡,2小时后崩解为细胞碎片,随着星状孢菌素浓度的下降,台盼蓝染色阳性率逐渐下降,降至10-7mol/L时其染色阳性率已经与正常对照组差异无统计学意义。2.荧光光漂白恢复率的测定:正常组,实验组和对照组细胞平均荧光恢复率经统计学分析,三组两两比较差异均有统计学意义,实验组低于正常组,高于对照组。3.Western-blot结果:Cx43蛋白在正常组,实验组和对照组的晶状体上皮细胞中均有表达,正常对照组为高表达,实验组表达低于正常组,对照组表达量最低,差异均有统计学意义。4.Cx43荧光标记定位结果:近紫外线照射后正常定位于晶状体上皮细胞膜上的Cx43发生了内移,实验组内化较对照组轻,并出现数量上的变化。结论近紫外线损伤可以导致晶状体上皮细胞形态改变,胞间通讯功能的受损,Cx43表达量减少和内化,星状孢菌素在近紫外线照射时,对晶状体上皮细胞胞间通讯具有保护作用,可以减缓连接蛋白表达量的减少和内化的程度,证实了近紫外线辐射通过激活PKC途径损害胞间通讯,从而导致白内障的发生。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：星状孢菌素在近紫外线辐射时对兔晶状体上皮细胞通讯功能的保护作用及其机制
• 前言
• 第一部分 体外培养兔晶状体上皮细胞近紫外线辐射模型建立和星状孢菌素药物浓度的选择
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 星状孢菌素在近紫外线辐射时对兔晶体上皮细胞通讯功能的保护作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 星状孢菌素在近紫外线辐射时对兔晶体上皮细胞通讯功能保护作用机制的探讨
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 致谢
• 研究生在读期间发表及待发表的论文