井冈霉素生物转化菌种的筛选与产物鉴定

论文摘要

井冈霉素（Validamycins）,又称有效霉素,是我国科学家沈寅初开发成功的一个农用抗生素,由吸水链霉菌变种（Streptomyces.hygroscopicus vag.jinggangensis）产生。井冈霉素对水稻纹枯病有较好的防治作用,以井冈霉素为原料开发井冈胺类物质是一种很有前景的方法。井冈胺类物质包括:井冈霉亚基胺A（Validoxylamine A）、井冈霉胺（Validamnie）、井冈胺（Valienamine）、井冈霉醇胺（Valiolamine）。井冈霉亚基胺A对海藻糖苷酶有一定的抑制作用,有望开发成为一种新型杀虫剂。井冈霉胺、井冈胺是糖苷酶如α-淀粉酶、糖化酶、蔗糖酶、麦芽糖酶的竞争性抑制剂,这两种物质可被开发成为药品或保健品,用于Ⅱ型糖尿病的防治,也可作为医药中间体合成一些降糖药,如伏格列波糖（Voglibose）和阿卡波糖（Acarbose）。本文研究探索出一条以微生物转化法降解井冈霉素生产井冈胺类物质的方法,该方法有高效、清洁、低成本等优点。通过混菌培养法,筛选出了能够转化井冈霉素为井冈霉亚基胺A的三株真菌:Y07F-1287、Y07F-1248、Y07F-1239。并根据形态学如菌落特征、菌丝体形态以及ITS序列分析,菌株Y07F-1287初步鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、Y07F-1248初步鉴定为木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、Y07F-1239初步鉴定为因卡纳镰刀菌（Fusarium incarnatum）。通过富集培养法,筛选出了能够转化井冈霉素为井冈霉胺的一株细菌:Y07B-0134。根据其生理生化特征及其16S rDNA序列分析,菌株Y07F-0134初步鉴定为多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）。对转化产生井冈霉胺的菌株Y07B-0134进行了转化条件的初步优化,优化结果为:培养时间5d;底物投料量2.5%;培养基初始pH6.5;以井冈霉素为唯一碳源;0.5%的硝酸铵作为氮源。结果表明,在优化的培养条件下,井冈霉胺的含量达到3.18mg·mL-1,摩尔转化率达28.89%,比优化前提高了19.37%。在对井冈霉亚基胺A的分离纯化过程中,采用阳离子树脂法分离产物,阴离子树脂脱色,乙醇沉淀产物,获得井冈霉亚基胺A的结晶,经HPLC法检测含量超过95%。在对井冈霉胺的分离纯化过程中,采用先后两次上样阳离子树脂法分离产物,阴离子树脂脱色,乙醇沉淀产物,获得井冈霉胺的结晶。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 井冈类化合物的概述
• 1.1 井冈霉素
• 1.2 井冈霉素的衍生物
• 2 井冈霉素裂解的研究
• 2.1 化学法
• 2.1.1 裂解井冈霉素为井冈霉亚基胺A
• 2.1.2 裂解井冈霉素为井冈霉胺和羟基井冈霉胺
• 2.1.3 裂解井冈霉亚基胺A为井冈胺或井冈霉胺
• 2.1.4 化学法合成井冈胺
• 2.2 固定化细胞法
• 2.3 微生物转化法
• 2.3.1 转化生产井冈胺及井冈霉胺的微生物
• 2.3.2 井冈霉素的裂解过程
• 2.4 从井冈霉素发酵液中提取井冈胺
• 3 井冈类物质的应用
• 3.1 井冈霉亚基胺A的应用
• 3.2 井冈胺类物质的应用
• 3.2.1 以井冈胺为原料制备伏格列波糖
• 3.2.2 以井冈霉胺为原料制备伏格列波糖
• 4 立题依据
• 第二章 井冈霉素生物转化菌种的筛选与鉴定
• 1 实验材料与设备
• 1.1 试剂、菌种及土样
• 1.2 实验设备
• 1.3 培养基配方
• 2 实验方法
• 2.1 HPLC法检测井冈霉亚基胺A
• 2.2 糖苷酶抑制法检测井冈霉胺的活性
• 2.2.1 溶液配制
• 2.2.2 猪小肠糖类分解酶粗提液的制备
• 2.2.3 糖苷酶抑制活性实验
• 2.2.4 结果的检测
• 2.3 筛选方法
• 2.3.1 琼脂块培养法筛选
• 2.3.2 混菌培养法筛选
• 2.3.3 富集培养法筛选
• 2.4 活性菌株的鉴定
• 2.4.1 真菌的鉴定
• 2.4.2 细菌的鉴定
• 2.5 活性菌株的培养方法
• 2.5.1 菌株Y07F-1239、Y07F-1248及Y07F-1287的培养方法
• 2.5.2 菌株Y07B-0134的基本培养方法
• 3 实验结果
• 3.1 微生物转化井冈霉素A的筛选结果
• 3.2 井冈霉亚基胺A产生菌的转化结果
• 3.3 糖苷酶抑制法检测井冈霉胺的活性结果
• 3.4 活性菌株的鉴定结果
• 3.4.1 真菌的鉴定结果
• 3.4.2 细菌鉴定结果
• 4 结果与讨论
• 4.1 实验结果
• 4.2 讨论
• 4.2.1 琼脂块筛选法与混菌培养法
• 4.2.2 富集培养法
• 第三章 井冈霉胺产生菌培养条件的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 基础培养基
• 2 实验方法
• 2.1 基础培养方法
• 2.2 底物投料量及培养时间的优化
• 2.3 转化培养基初始pH的优化
• 2.4 培养基碳、氮源的添加实验
• 2.5 菌体生长代谢曲线的测定
• 2.6 底物降解及产物生成的测定
• 3 实验结果
• 3.1 井冈霉胺最低检测限的考察
• 3.2 井冈霉胺标准曲线的绘制
• 3.3 基础培养方法的转化结果
• 3.4 底物投料量与转化时间的优化结果
• 3.5 转化培养基初始pH值的优化结果
• 3.6 碳源添加实验结果
• 3.7 氮源添加实验结果
• 3.8 菌体生长代谢曲线的测定
• 3.9 转化时间的考察
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第四章 井冈霉素生物转化产物的检测与分离
• 1. 实验材料
• 1.1 实验试剂
• 1.2 实验仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 转化产物的检测
• 2.1.1 TLC法检测井冈霉亚基胺A和井冈霉胺
• 2.1.2 HPLC法检测井冈霉亚基胺A
• 2.1.3 糖苷酶抑制剂法检测井冈霉胺
• 2.2 转化产物的分离
• 2.2.1 树脂的预处理、再生和转型
• 2.2.2 井冈霉亚基胺 A的分离
• 2.2.3 井冈霉胺的分离
• 2.3 转化产物的鉴定
• 3. 实验结果
• 3.1 转化产物的检测结果
• 3.1.1 TLC法检测结果
• 3.1.2 HPLC法检测结果
• 3.2 转化产物的分离结果
• 3.2.1 井冈霉亚基胺A的分离结果
• 3.2.2 井冈霉胺分离条件的考察结果
• 3.3 转化产物的鉴定结果
• 3.3.1 井冈霉亚基胺 A的鉴定
• 3.3.2 井冈霉胺的鉴定
• 4. 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢