超嗜热古菌Thermococcus siculi HJ21产高温α-葡萄糖苷酶的研究

论文摘要

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase, EC 3.2.1.20）又称麦芽糖酶（maltase）和α-转移葡萄糖苷酶（α-transglucosidase, EC 2.4.1.24）,可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开α-1,4糖苷键,释放出葡萄糖,或将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一个底物上,从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖（IMO）、糖脂或糖肽等。α-葡萄糖苷酶在淀粉加工工业中可以用作糖化酶制剂,与α-淀粉酶一起生产高葡萄糖浆。另外,α-葡萄糖苷酶作为工业化生产IMO的关键酶制剂备受国内外食品工业界的重视。目前,工业生产中使用的α-葡萄糖苷酶主要来源于黑曲霉（Aspergillus niger）。对一株分离自深海热液口的超嗜热古菌（Thermococcus siculi HJ21）菌株进行了产α-葡萄糖苷酶条件的优化和酶学性质的初步研究。胞内发酵时间为6 h,胞外发酵时间为21 h时,较适合产α-葡萄糖苷酶;其最适产酶温度为85℃,pH为6.5,NaCl浓度为2.5 %;可溶性淀粉、酵母粉和蛋白胨促进产酶。该α-葡萄糖苷酶的最适作用温度为100℃,90℃半衰期为2 h;最适酶作用pH值为7.0,在pH为5.0～8.0之间酶活力相对稳定;该酶热稳定性不依赖Ca2+,且Ca2+对该酶有抑制作用,金属离子Cu2+、Al3+、Ni2+对该酶有较明显抑制作用,Hg2+强烈抑制该酶的活性,而EDTA、Fe3+和K+对该酶有激活作用。以T. siculi HJ21染色体DNA为模板,采用PCR技术,成功克隆了T. siculi HJ21的α-葡萄糖苷酶基因。基因序列结果显示,该基因开放阅读框大小为729 bp,编码的蛋白质分子含有242个氨基酸残基,分子量约27.2kDa。同Genbank数据库中已公开的α-葡萄糖苷酶基因序列进行同源性比对分析结果表明,T. siculi HJ21的α-葡萄糖苷酶的基因序列与Thermococcus hydrothermalis的α-葡萄糖苷酶亲缘关系最近,同源性达到81%,氨基酸同源性达90%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 古菌
• 1.2 嗜热酶
• 1.3 α-葡萄糖苷酶的研究现状及进展
• 1.3.1 α-葡萄糖苷酶的理化性质
• 1.3.2 α-葡萄糖苷酶的化学构成与结构
• 1.3.3 α-葡萄糖苷酶检测方法
• 1.3.4 α-葡萄糖苷酶在细胞中的分布
• 1.4 α-葡萄糖苷酶的应用
• 1.4.1 生产低聚异麦芽糖
• 1.4.2 在啤酒酿造中的应用
• 1.4.3 其它方面的应用
• 1.5 立题背景及研究内容
• 1.5.1 立题背景与意义
• 1.5.2 主要研究内容
• 第二章 α-葡萄糖苷酶产酶条件的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器及来源
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 培养方法
• 2.2.6 粗酶液的制备
• 2.2.7 α-葡萄糖苷酶活力测定方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 发酵时间对产酶的影响
• 2.3.2 温度对产酶的影响
• 2.3.3 培养基初始pH 对产酶的影响
• 2.3.4 培养基NaCl 浓度对产酶的影响
• 2.3.5 碳源对产酶的影响
• 2.3.6 氮源对产酶的影响
• 2.3.7 发酵条件的正交优化
• 2.4 本章小结
• 第三章 α-葡萄糖苷酶粗酶酶学性质研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 培养方法
• 3.2.5 粗酶液的制备
• 3.2.6 酶活力的测定
• 3.2.7 酶学性质的研究
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 温度对酶活力的影响
• 3.3.2 酶的热稳定性
• 3.3.3 酶的pH 稳定性
• 3.3.4 pH 值对酶稳定性的影响
• 3.3.5 金属离子和化学试剂对酶活力的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 α-葡萄糖苷酶基因的克隆
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株与质粒
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要化学试剂
• 4.2.4 实验仪器设备
• 4.2.5 T. siculi HJ21 总DNA 的提取
• 4.2.6 引物的设计与合成
• 4.2.7 PCR 扩增及电泳检测
• 4.2.8 PCR 反应产物的纯化
• 4.2.9 E. coli 感受态制备
• 4.2.10 质粒DNA 的提取
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 T. siculi HJ21 总DNA 的提取
• 4.3.2 基因组DNA 的纯度
• 4.3.3 α-葡萄糖苷酶基因片段的PCR 扩增
• 4.3.4 α-葡萄糖苷酶基因序列拼接
• 4.3.5 α-葡萄糖苷酶基因序列分析
• 4.3.6 α-葡萄糖苷酶基因在E. coli 中的表达
• 4.4 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文