论文摘要
膀胱肿瘤是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤,具有多发、高复发性的特点,且随着复发,其恶性程度也呈增高趋势,最终发生浸润转移而危及生命。如何提高膀胱肿瘤的治疗效果是目前泌尿外科领域未解决的难点和一大课题。随着对肿瘤发病机制研究的深入,人们逐渐认识到肿瘤的生长、浸润和转移都需要依赖新生血管的形成。研究显示,当肿瘤长至12mm,即需要有新生血管供应,否则肿瘤细胞因缺血缺氧出现死亡,并由此提出了治疗肿瘤的新途径—抗血管生成治疗,为实体肿瘤的治疗提供了新的思路,并形成了抗肿瘤血管生成疗法。与传统的肿瘤治疗相比较,抗肿瘤血管生成策略有较多的优势:作用强,易于到达血管靶细胞,不产生耐药性,无明显毒副作用。虽然近年来抗肿瘤血管生成治疗的研究取得了令人瞩目的成果,国外已有多种此类药物进入临床应用或实验研究,显示出良好的效果,但还存在明显的不足之处:①这些治疗分子都是从外界施加的,作用时间短,必需持续给药;②由于这些分子可溶性方面的限制,需要大剂量静脉给药,使得毒性大为增加。血管内皮生长因子（VEGF）是目前已知的最重要促血管生成因子。多数肿瘤组织和肿瘤细胞株均过量表达VEGF。VEGF主要通过与高亲和力酪氨酸激酶受体血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）结合而发挥生物学活性,VEGF/VEGFR-2信号转导通路被证实在肿瘤血管生成过程中起关键性作用。通过阻断该信号转导通路,可以达到抑制肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤的生长和转移的目的。根据这一原理,我们设计了阻断VEGF与其受体相互作用的新的治疗方案:构建含VEGFR-2（Flk1）胞外段和IgG2a Fc段融合基因的腺病毒载体Ad-Flk1-Fc,转染膀胱肿瘤细胞和血管内皮细胞,使之表达分泌游离的融合Flk1-Fc,后者在肿瘤细胞和新生血管内皮细胞生长的微环境中可捕获血液中的VEGF,阻断细胞自/旁分泌产生的VEGF与VEGFR-2的结合,从而抑制血管生成和肿瘤的生长,为临床治疗膀胱肿瘤提供高效、安全新方法。主要研究内容和结果如下:第一部分腺病毒载体Ad-Flk1-Fc的构建与表达1.腺病毒载体Ad-Flk1-Fc的构建:扩增并提取含有Flk1-Fc片段的质粒pCD-Flk1-Fc,用XbaⅠ、BamHⅠ进行双酶切,产物用琼脂糖凝胶电泳,显示得到约5.1kp的酶切片段,与目的基因理论值相符。将腺病毒穿梭质粒载体pshuttle-CMV双酶切线性化后,插入腺病毒穿梭载体质粒pshuttle-CMV巨细胞病毒启动子下游,构建腺病毒穿梭质粒载体pShuttle-CMV-Flk1-Fc。用Pme I线性化后,转化到含有AdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,与其中的AdEasy-1进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd--Flk1-Fc。2.腺病毒载体Ad-Flk1-Fc的包装:重组腺病毒质粒pAd-Flk1-Fc转染人胚肾293细胞,转染48h后在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光,表明质粒转染成功,外源基因开始表达,培养一天后开始收集上清,得到复制缺陷型腺病毒Ad--Flk1-Fc。用得到的质粒重复感染HEK293A,大量扩增腺病毒Ad-Flk1-Fc。用氯化铯梯度离心法纯化重组腺病毒,利用半数组织培养感染剂量法测得重组腺病毒最终的滴度为2×109PFU /ml。3.腺病毒Ad-Flk1-Fc的表达与鉴定:用包装后的腺病毒转染膀胱肿瘤BTT739细胞,提取细胞中的总蛋白,用抗Flk1抗体进行Western blot鉴定,结果显示有分子量为165kD的蛋白表达,与Flk1-Fc融合蛋白的理论分子量相同。将Ad-Flk1-Fc转染COS-7细胞后,进行免疫细胞化学染色检测Flk-1表达,Ad-Flk1-Fc转染细胞为阳性,而对照组则为阴性,进一步证实融合蛋白Flk1-Fc的表达。以上结果显示,实验成功构建了腺病毒载体Ad-Flk1-Fc,并在膀胱肿瘤BTT739等真核细胞中表达融合蛋白Flk1-Fc。第二部分Ad-Flk1-Fc在体外对血管内皮细胞（HUVEC）的作用1. Ad-Flk1-Fc细胞培养上清液对HUVEC的生长抑制作用:首先体外培养HUVEC,用Ad-Flk1-Fc转染膀胱肿瘤BTT739细胞培养上清液（即融合蛋白Flk1-Fc）处理离体培养的HUVEC,并设置Ad-Fc、pAd及PBS对照组,采用内皮细胞增殖抑制实验（MTT法）,接种48h后,对照组细胞增殖迅速,Ad-Flk1-Fc组细胞数量较对照组有明显减少,与空白对照组相比HUVEC生长抑制率分别为Ad-Flk1-Fc组（53.08%）、Ad-Fc组（13.86%）、pAd组（14.38%）。结果显示Ad-Flk1-Fc细胞培养上清液对HUVEC细胞生长有明显抑制作用,而其它三组的HUVEC细胞的生长无抑制作用（p<0.01）。2. Ad-Flk1-Fc细胞培养上清液诱导HUVEC凋亡的作用:流式细胞仪检测Ad-Flk1-Fc细胞培养上清液对血管内皮细胞凋亡的影响,实验分组同上述,检测结果显示Ad-Flk1-Fc组的凋亡率为42.93%,明显大于Ad-Fc组（20.36%）、pAd组（19.45%）及PBS组（18.58%）。其可以显著诱导HUVEC凋亡（p<0.01）。3. Ad-Flk1-Fc细胞培养上清液抑制HUVEC迁移的作用:通过Transwell试验观察Ad-Flk1-Fc细胞培养上清液对HUVEC在Transwell中的迁移的影响,实验分组同上,Ad-Flk1-Fc组的抑制率为53.19%,而Ad-Fc组和pAd组分别为12.0%及2.4%,上清液对HUVEC迁移有明显的抑制作用（p<0.01）。4. Ad-Flk1-Fc细胞培养上清液抑制HUVEC管状化的作用:在Matrigel胶中观察发现,Ad-Flk1-Fc细胞培养上清液对HUVEC内皮小管管腔样结构的形成有显著的抑制作用。以上结果提示:Ad-Flk1-Fc转染膀胱肿瘤BTT739细胞培养上清液（融合蛋白Flk1-Fc）在体外对HUVEC的生长、迁移及管状化具有明显的抑制效应,而对HUVEC凋亡有明显的诱导作用,为Ad-Flk1-Fc后期的开发和应用奠定了理论基础。第三部分pAd- Flk1-Fc对可移植性小鼠膀胱肿瘤治疗效应的研究1. Ad-Flk1-Fc的抑瘤效应:T739小鼠48只,随机分4组,12只/组。每组再分为两个亚组,分别为动态组和病理组。动态组主要观察:①肿瘤体积变化:每周测两次,至其中一组小鼠死亡达到一半时停止测量;②生存率:观察记录荷瘤小鼠死亡情况,观察期2个月。病理组小鼠第21天时处死,剥离肿瘤,测量体积,并称重,计算瘤重和体积抑制率后进行病理检查。小鼠皮下种植等基因小鼠膀胱肿瘤细胞BTT739的同时,注射Ad-Flk1-Fc2×109 PFU,2次/wk,共2 wk、并设置Ad-Fc、pAd及PBS对照组。结果显示:Ad-Flk1-Fc治疗组荷瘤鼠的平均瘤重和平均体积均显著低于Ad-Fc、pAd及PBS对照组;而肿瘤抑制率和荷瘤鼠生存时间则均显著大于其它三组。2. Ad-Flk1-Fc对肿瘤血管生成的抑制效应:Ad-Flk1-Fc治疗后进行膀胱肿瘤病理检查,有明显的肿瘤细胞坏死。根据CD31抗原标记肿瘤内皮细胞计算MVD,在所有的膀胱肿瘤组织中都能计数到MVD,阳性染色多位于肿瘤细胞之间,微血管形态不一,呈星状、裂隙状或分支状。肿瘤巢内多呈片状或灶状分布。计数结果表明Ad-Flk1-Fc组MVD值明显低于其它三组（P<0.01）。采用原位末端标记（TUNEL）法检测肿瘤细胞凋亡情况,Ad-Flk1-Fc治疗组明显高于其它三组（P<0.01）。3. Ad- Flk1-Fc对非肿瘤血管新生的抑制效应:BTT739小鼠24只,同上随机均分为4组,于皮下注射含0.4ug/ml小鼠VEGF的Matrigel胶诱导血管新生,然后同上分别注射Ad-Flk1-Fc、Ad-Fc、pAd及PBS。再利用携带荧光素的Isolectin B4对内皮细胞进行染色及定量检测,Ad-Flk1-Fc治疗组的荧光强度明显低于其它三组。以上结果显示Ad-Flk1-Fc对移植性小鼠膀胱肿瘤及肿瘤的血管生成具有抑制效应,并延长荷瘤鼠的生存期。结论:1.成功构建了腺病毒载体Ad-Flk1-Fc,并在膀胱肿瘤BTT739等真核细胞中表达融合蛋白Flk1-Fc。2. Ad-Flk1-Fc转染膀胱肿瘤BTT739细胞培养上清液（即融合蛋白Flk1-Fc）在体外对HUVEC的生长、迁移及管状化具有明显的抑制效应,而对HUVEC凋亡有明显的诱导作用。3. Ad-Flk1-Fc对移植性小鼠膀胱肿瘤具有抑瘤效应,并延长荷瘤鼠的生存期,其抑瘤机制主要是抑制了肿瘤的血管生成。本研究为新型抗膀胱肿瘤药物Ad-Flk1-Fc的开发和应用奠定了良好的基础。
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相关论文文献
- [1].Ad-Flk1-Fc抗膀胱肿瘤血管生成作用研究[J]. 第四军医大学学报 2009(21)
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