论文摘要
核酸疫苗又称基因疫苗、DNA疫苗,是近年来随着基因治疗技术的发展而产生的一种新型疫苗,核酸疫苗和传统疫苗相比有着显著的优势,免疫后能够同时诱导体液免疫和细胞免疫,不仅具有预防疾病的作用,同时还具有治疗疾病的功效,所以治疗性核酸疫苗成为近些年研究的重点。并迅速地从治疗传染性疾病的研究扩展到非传染性疾病的研究,为乙型肝炎、囊虫病等一系列感染性疾病的防治开辟了新的领域。尽管核酸疫苗得到了快速发展和广泛的应用,但其总的免疫效果还存在一定的缺陷。存在某些核酸疫苗在小动物实验中免疫效果很好,但是在大动物实验中效果不理想；有的核酸疫苗在动物实验中能起到很好的免疫保护作用,但在临床试验中却不能保护受试者抵抗病原体的侵害。如何提高核酸疫苗的免疫效果、阐述核酸疫苗的免疫机制成为核酸疫苗发展的核心问题。鉴于核酸疫苗的免疫原性低,近年来大量的研究尝试通过新的免疫剂型、免疫方案等多种免疫策略来改善核酸疫苗的免疫效果。本课题通过使用DNA疫苗的免疫新剂型微针注射辅以疫苗佐剂Flt3L的方法来提高乙肝DNA疫苗的免疫效果。通过我们的研究发现微针注射辅以细胞因子Flt3L联合免疫的策略,能明显地增强乙肝DNA疫苗体液免疫和细胞免疫。微针是在新型电子行业发展的基础上衍生的新技术,通过氢氧化钾腐蚀技术将化学聚合物、硅等焊接到1平方厘米的芯片上形成的聚合针列,其高度在50微米到200微米能够有效穿透皮肤表层和角质层到达活性表皮层,而皮肤尤其是活性表皮富含抗原提呈细胞,一直被认为是高免疫活性部位,通过微针将核酸疫苗靶向给药于表皮层,可以直接作用与抗原提呈细胞从而提高免疫效果。Flt3L是近年来的被广泛关注的一种免疫刺激分子,能够增强T细胞依赖性和T细胞非依赖性2种途径的T细胞的增殖。不仅如此Flt3L还能够诱导抗原提呈细胞DC的分泌和活化、在炎症部位募集DC等抗原递呈细胞。从不同免疫组合中我们比较得到微针介导细胞因子Flt3L能够明显的增强疫苗的体液免疫和细胞免疫水平。本课题系统地考察了这种新的免疫方案的免疫效果,并探讨了其增效的分子机制。结果表明微针介导细胞因子Flt3L注射能够显著增强核酸疫苗的免疫原性,增强疫苗免疫效果。核酸疫苗的安全性问题也一直制约着核酸疫苗的发展,近年来有研究发现pcDNA3负载的核酸疫苗诱发了实验动物的自身免疫疾病,研究者对实验动物解剖后发现了肾脏的病变,进一步深入的研究发现体内核酸疫苗持续产生的抗原抗体复合物的沉积诱发了肾小球基底膜病变。其确切机制仍不明了,此外,自然杂志上也报到了常用佐剂分子CpG序列诱发实验动物肝脏病变的现象。核酸疫苗免疫原性低的问题限制了核酸疫苗的广泛应用。为了提高免疫效果,大量的免疫策略被尝试。CpG序列是常用的佐剂分子,无论是pcDNA3载体骨架上负载的CpG序列或者是寡核苷酸CpG都可以起到都可以起到免疫增效的作用,然而是否CpG的使用存在某些安全隐患,需要进一步考证。多年来本课题组致力于核酸疫苗的机制研究,为了阐明核酸疫苗免疫诱发的不安全因素及其分子机制,我们以pVAX1、pcDNA3质粒为载体构建了表达AnnexinB1抗原的DNA疫苗,对C57BL/6小鼠实施了3次免疫接种,通过检测小鼠的总抗体滴度、T细胞增殖的能力、CTL活性来判断核酸疫苗的免疫效果,研究结果表明,含有CpG序列的pcDNA3-B1疫苗组的确诱导了更有效的免疫保护效果,但是在研究我们意外的发现pcDNA3-B1疫苗组诱发了局部黑色素丢失的免疫损伤现象,为了揭示这一免疫损伤的诱发因素和分子机制,本研究通过脾脏比较蛋白质组学的方法,寻找在免疫过程中发生改变的蛋白质,以这些显著改变的蛋白分子为桥梁寻找到核酸疫苗免疫后参与调控的信号通路,以期能阐明核酸疫苗诱发自身免疫病的分子机制。通过蛋白质组学的结果以及后续的生物信息学手段我们挑选了核酸疫苗组间差异显著的5个蛋白,在pcDNA3-B1组显著上调的2个蛋白和下调的3个蛋白,进一步通过文献检索、聚类分析以及功能分析确定了其中上调的一个蛋白growth factor receptor bound protein 2的生理功能和pcDNA3能够诱导更佳的免疫保护存在着潜在的联系,而下调蛋白中的2个蛋白proxiredoxin 1和proxiredoxin 6属于prdx蛋白家族成员,该家族成员的主要生理功能是在体内降解过氧化氢、超氧离子等反应活性氧,而体内反应活性氧和氧化应激的发生有着重要的关系,进一步的研究发现实验动物体内proxiredoxin 6蛋白的下调导致体内反应活性氧的富集,进而诱发了体内氧化应激的产生最终激发自身免疫病的产生。通过本研究,我们阐明了核酸疫苗免疫诱发的相关疾病的分子机制,为DNA免疫诱发的相关疾病的治疗提供了靶点,为核酸疫苗的临床安全使用提供重要的理论依据。