IgG对中枢神经系统小胶质细胞TLR4表达及分泌细胞因子的作用

论文摘要

中枢神经系统（CNS）是免疫特免区,缺乏淋巴系统,并有血脑屏障（BBB）的保护。小胶质细胞是迁移、定居或起源于脑内的驻留型巨噬细胞。许多生理或病理因素如血压的突然变化、免疫刺激和外伤等均可导致BBB破坏、通透性升高,使血循环中的蛋白渗入CNS,渗入的IgG可以被小胶质细胞吞噬,但这些渗入的内源性蛋白对CNS免疫会产生怎样的影响并不清楚。模式识别受体（PRR）的深入研究极大地发展了固有免疫反应机制的理论。TLR4是PRR的一个重要成员,在CNS主要表达在小胶质细胞,且在CNS固有免疫和适应性免疫应答的启动中扮演重要的角色。本研究采用几种非感染性CNS损伤引起IgG渗入CNS的动物模型,在体观察了渗入的内源性IgG与CNS小胶质细胞TLR4表达的关系;同时测定了同种属IgG对原代培养的新生大鼠胶质细胞TLR4表达以及细胞因子分泌的作用。1. BBB开放导致内源性IgG渗入CNS实质后小胶质细胞TLR4的表达:制做一过性高血压模型、免疫刺激模型、缺血再灌模型和无菌脊髓挤压伤模型,以外周LPS作为阳性对照,应用免疫荧光染色和RT-PCR,观察比较TLR4在上述几种模型CNS中的表达。结果显示,与阴性对照组相比,所有模型动物的TLR4主要表达在IgG渗出区内。肾上腺素注射造成的一过性高血压可以进一步加重LPS的效应,且TLR4免疫反应阳性产物除了在血管内皮细胞之外还出现在小胶质细胞。这些结果提示,TLR4在小胶质细胞的表达与IgG渗入CNS密切相关。2. IgG刺激诱发培养的小胶质细胞表达TLR4与分泌细胞因子:分离培养纯化的新生大鼠的小胶质细胞,用免疫荧光和ELISA方法检测了同种属（大鼠）IgG刺激后TLR4和CD64（IgG Fc段I型受体）的表达和炎性细胞因子分泌的变化。结果显示,TLR4和CD64的表达在IgG刺激后都明显上调,且共存于小胶质细胞。相对于LPS刺激和空白组,IgG刺激在上调TLR4的同时,还导致小胶质细胞形态变大、伸出多个伪足,呈现为活化的吞噬状态。与空白对照组相比,IgG刺激24 h后,细胞培养上清中的TNF-α水平显著升高,但比LPS刺激组低。而IFN-γ在LPS和IgG组均低于空白组。这些结果表明IgG引起纯化的小胶质细胞表达TLR4,并且增加了TNF-α的分泌。提示TLR4可被同种IgG激活,触发髓样分化蛋白88（Myeloid differentiation protein 88,MyD88）依赖的信号途径。3. IgG刺激诱发培养的混合胶质细胞TLR4表达与分泌细胞因子:从新生大鼠分离培养原代混合胶质细胞,加入IgG或LPS刺激24 h,用免疫荧光方法观察CD64和TLR4的表达;ELISA检测培养上清中细胞因子的分泌。结果显示,与纯化的小胶质细胞相似,IgG刺激后培养的混合胶质细胞（绝大多数为星型胶质细胞）CD64和TLR4的表达上调,且只表达于小胶质细胞。LPS刺激后,培养上清液中TNF-α升高,IgG刺激后的混合培养上清液中检测不到TNF-α和IFN-γ。IL-1β在较高浓度IgG和适中浓度LPS刺激后培养上清液中显著升高;用免疫荧光法检测显示:IgG刺激后的星型胶质细胞、小胶质细胞胞浆中IL-1β表达升高。这些结果显示,在培养的混合胶质细胞中（1）小胶质细胞是CNS胶质细胞中最重要的免疫反应细胞,能够对IgG刺激产生TLR4和CD64表达上调的反应;（2）不同类型胶质细胞之间存在相互作用。上述结果证明,内源性的IgG可以引起CNS小胶质细胞TLR4和CD64的表达上调,并通过激活TLR4下游信号通路产生炎性细胞因子。提示内源性大分子蛋白在BBB开放条件下进入CNS后,可刺激小胶质细胞的TLR4和CD64表达上调而引发固有免疫反应,从而导致某些CNS自身免疫疾病的发生。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 中枢神经系统的免疫学特性
• 1.1 CNS 的“免疫特免”理论
• 1.1.1 血脑屏障
• 1.1.2 CNS 的抗原提呈细胞
• 1.2 血浆蛋白进入CNS 的研究进展
• 1.2.1 血浆蛋白进入CNS 的条件
• 1.2.2 血浆IgG 进入CNS 后如何发挥效应
• 1.3 Toll 样受体（TLRs）
• 1.3.1 TLRs 的发现
• 1.3.2 TLRs 的家族成员与分布
• 1.3.3 TLRs 结构特点
• 1.3.4 TLRs 识别病原体的途径
• 1.3.5 TLRs 介导的信号转导
• 第二章 不同CNS 损伤模型大鼠脑内IgG 的渗出及其与TLR4 表达的关系
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.1.5 动物模型建立与处理
• 2.1.6 IgG 和TLR4 的免疫荧光检测
• 2.1.7 RT-PCR 法检测TLR4 mRNA 水平
• 2.1.8 统计学分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 各种模型IgG 的渗出与TLR4 的表达
• 2.2.2 TLR4 mRNA 的表达
• 2.3 讨论
• 2.3.1 多种CNS 损伤均伴有血浆IgG 的渗入
• 2.3.2 内源性IgG 渗出区有TLR4 的表达
• 2.3.3 LPS 引起的CNS 损伤、IgG 渗入CNS 与TLR4 表达
• 2.3.4 IgG 渗入可能引起TLR4 活化的机制
• 2.4 小结
• 第三章 同种属IgG 对培养的小胶质细胞TLR4 的表达及分泌细胞因子的作用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要试剂的配制
• 3.1.5 小胶质细胞的分离与纯化
• 3.1.6 IgG 引起小胶质细胞TLR4、CD64 表达的检测
• 3.1.7 IgG 引起的培养的小胶质细胞TNF-α和IFN-γ的分泌
• 3.2 结果
• 3.2.1 小胶质细胞的培养与纯化结果
• 3.2.2 小胶质细胞TLR4 和CD64 表达的检测
• 3.2.3 IgG 刺激对培养的小胶质细胞分泌细胞因子的作用
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 同种属IgG 对培养的混合胶质细胞TLR4 的表达与分泌细胞因子的作用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要试剂的配制
• 4.1.5 胶质细胞的分离培养
• 4.1.6 IgG 引起培养的混合胶质细胞TLR4、CD64 以及IL-1β的检测
• 4.1.7 IgG 引起培养的混合胶质细胞上清中细胞因子分泌的作用
• 4.2 结果
• 4.2.1 IgG 引起胶质细胞TLR4、CD64 以及IL-1β的表达
• 4.2.2 IgG 刺激对培养的混合胶质细胞分泌细胞因子的作用
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 图表说明
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介