结核分枝杆菌RmlB的表达、纯化及酶促反应动力学研究

论文摘要

由结核分枝杆菌引起的结核病是严重危害人类健康的传染病,主要的原因是耐多药的结核分枝杆菌菌株的增加,而现有的抗结核药物不能有效的治愈结核病,所以每年有900万的新增病例,300万人死亡。研究新一代的抗结核药物迫在眉睫。细胞壁是分枝杆菌赖以生存的结构基础,所以结核分枝杆菌的细胞壁可以作为新药研发的靶标。其核心结构由肽聚糖,聚阿拉伯糖半乳糖和分枝菌酸组成,其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通过衔接双糖L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺共价连接到肽聚糖分子上,如果破坏了衔接双糖的结构,就会破坏结核分枝杆菌的细胞壁,导致细胞的死亡。由于人体中不存在鼠李糖分子,因此鼠李糖可以作为研发新一代抗结核药物的重要靶点。结核分枝杆菌基因组中rmlA-D四种基因编码了RmlA-D四种酶,参与了由底物1-磷酸葡萄糖合成dTDP-L-鼠李糖的过程。所以RmlA-D四种酶的任一种酶都可作为开发抗结核新药的靶标。结核分枝杆菌RmlB即dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱氢酶是dTDP-L-鼠李糖合成过程中第二步反应所需的酶。为了深入研究RmlB的活性,我们首先要克隆编码这种酶的rmlB基因,然后利用大肠杆菌高效表达RmlB蛋白质,为进一步研究RmlB酶的酶促反应动力学及建立筛选抗结核药物的酶反应体系提供物质保障。本论文的目的是:（1）用PCR法从结核分枝杆菌基因组DNA中扩增Tb rmlB基因;（2）将Tb rmlB基因克隆到pMD18-T的克隆载体中,并对DNA序列进行测定;（3）将Tb rmlB基因亚克隆到pET29b表达载体中并通过改变不同的诱导条件在大肠杆菌BL21（DE3）中表达RmlB蛋白质;（4）用亲和层析法纯化重组RmlB蛋白质,并用Western Blotting方法鉴定RmlB蛋白质;（5）建立测定RmlB酶的活性;（6）确定RmlB酶的最佳反应条件并测定RmlB酶的反应动力学常数。本论文所获得的结果如下:1.用PCR方法对目的基因Tb rmlB的扩增从结核分枝杆菌H37R菌株基因组数据库（http://genolist.pasteur.f -r./TubercuList/）中获得Tb rmlB基因的核苷酸序列（996 bp）。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物,并在上游引物和下游引物的5’端分别引入Nde I和Xho I限制性内切酶位点。以便将Tb rmlB基因克隆到pET29b表达载体的Nde I和Xho I位点。用具高保真的primer STARTMHS聚合酶,以H37Rv菌株基因组DNA为模板成功扩增了Tb rmlB基因。2. pMD18-Tb rmlB的构建及核苷酸序列测定将纯化的PCR产物与pMD18-T载体进行连接,然后将连接产物转化入大肠杆菌NovaBlue菌株的感受态细胞中。用限制性内切酶酶切的方法鉴定阳性重组质粒。对pMD18-Tb rmlB中的Tb rmlB基因进行DNA序列测定,对DNA测序结果进行BLAST分析,将所测得的核苷酸序列与Tb rmlB基因进行序列比对,发现在798 bp处由G变为T,但氨基酸序列未发生任何改变,表明在本实验中利用PCR方法获得的Tb rmlB为正确的基因,理论上能够正确表达出Tb RmlB蛋白。3.表达载体pET29b-Tb rmlB的构建用Nde I和Xho I双酶切pMD18-Tb rmlB质粒,回收和纯化rmlB基因,将其连接到pET29b表达载体的Nde I和Xho I位点,构建pET29b-Tb rmlB表达质粒。用Nde I和Xho I双酶切的方法鉴定阳性重组质粒。RmlB蛋白的C端与质粒上的组氨酸标签形成融合蛋白。4. Tb RmlB蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达和纯化将pET29b-Tb rmlB质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中,加入IPTG ,使其终浓度达到0.5 mM , 15℃振荡培养过夜。诱导携带pET29b-Tb rmlB质粒的BL21（DE3）表达重组蛋白。用超声方法破碎诱导后的BL21（DE3）,对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明RmlB蛋白在BL21（DE3）中可溶性表达。采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化RmlB蛋白,对纯化的蛋白进行蛋白质定量（考马斯亮蓝法）,第1 ml RmlB蛋白的浓度为1.533 mg/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明RmlB蛋白的纯度高。5.建立测定RmlB酶活性的方法将反应底物dTDP-Glucose和NAD+与纯化的RmlB酶蛋白在30℃反应30分钟,用1 M NaOH终止反应,然后利用754分光光度计检测340 nm处的吸光度值,吸光度值明显增加表明有产物的生成,纯化的RmlB蛋白质具有酶活性。6.确定RmlB酶的最佳反应条件分别改变反应的温度和反应的pH值,利用754分光光度计检测340 nm处的吸光度值的增加反应产物的生成量。结果表明RmlB酶蛋白的最适反应温度是30℃,最适pH值是7.5。7.测定RmlB酶的反应动力学常数。采用最佳的酶反应条件,即30℃,pH值是7.5,酶浓度是0.05 mg/ml,反应时间是30分钟。分别用不同的底物浓度,进行酶促反应,然后用1 M NaOH终止反应。利用754分光光度计检测340 nm处的吸光度值反应产物的生成量。用双倒数作图法得出RmlB的Km值和Vmax。对于底物dTDP-Glucose, Km = 3.965 mmol/L, Vmax = 4.2513 mmol/（L.min）。结论:在本研究中,我们构建了pET29b-Tb rmlB表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达出大量的可溶性RmlB蛋白。用纯化的蛋白研究酶的活性,确定了RmlB的最佳反应条件并测定了RmlB酶蛋白的反应动力学常数Km和Vmax。为建立完善的筛选抗结核药物的酶反应体系奠定了基础。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料与方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢