姜黄素抗角膜基质细胞纤维化的初步研究

论文摘要

角膜受到创伤或手术后,受损的上皮细胞诱导角膜浅基质层细胞凋亡,新形成的角膜基质胶原纤维紊乱排列,邻近的角膜细胞活化并增殖为成纤维细胞,活化的成纤维细胞向伤口处移行,即构成了不透明的角膜瘢痕组织,并完成角膜伤口愈合过程。其中活跃增生的角膜基质细胞在纤维化过程中发挥重要作用。然而,角膜过度纤维化会导致瘢痕形成严重,降低角膜透明度,如瘢痕位于角膜中央,则会严重影响视功能。目前,用于控制角膜过度纤维化的药物主要有皮质类固醇和抗代谢药物等,但由于具有明显的副作用而限制了它们的临床应用。因此,寻找安全有效的控制角膜基质细胞过度纤维化的药物一直是角膜创伤愈合研究和临床工作中的重要课题。姜黄素（curcumin）是从姜科植物姜黄中提取的一种植物多酚,其药理作用尤其抗纤维化作用逐渐引起人们的重视,成为研究热点。有研究表明,姜黄素可明显减轻肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化程度,但有关姜黄素是否会影响角膜基质细胞纤维化的研究尚少。本研究预培养离体小鼠角膜基质细胞,并将不同质量浓度的姜黄素分别作用于小鼠角膜基质细胞向角膜基质成纤维细胞方向转化的过程中,用逆转录聚合酶链式反应法（reverse transcription PCR, RT-PCR）、MTS法及免疫荧光法等观察不同质量浓度姜黄素对这一过程的影响,以探讨姜黄素的抗角膜基质纤维化的作用,为角膜创伤后瘢痕愈合的临床用药提供参考。目的：观察不同质量浓度姜黄素对这一过程的影响,以探讨姜黄素的抗角膜基质纤维化的作用,为角膜创伤后瘢痕愈合的临床用药提供参考。方法：1选取清洁级健康BALB/c小鼠,6-8周龄,体重25-30g,雌雄不限,无眼部疾病。将小鼠断颈处死,眼球剜出后置于含4 g/L庆大霉素的PBS中浸泡15 min。无菌环境下,将角膜沿角巩膜缘剪下,置于含20mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA NA2）的PBS中,37℃条件下孵育45 min。手术显微镜下,用显微镊子撕除角膜上皮以及内皮后,将角膜基质置于含3×105U/LⅠ型胶原酶的DMEM中,37℃条件下消化4 h后离心,再将角膜基质细胞重悬于DMEM中。在光学显微镜下观察该原代角膜基质细胞的形态学特征。2以原代角膜基质细胞为受试对象,DMEM+10%FBS做为诱导剂,将原代角膜基质细胞以相同数量级（5×104个/L）培养于以下五组培养液中：（1）对照组：即角膜基质细胞诱导组（DMEM+10%FBS,含1‰DMSO）。（2）低剂量组（DMEM+10%FBS+7.5 m/L姜黄素,含1‰DMSO）。（3）中剂量组（DMEM+10%FBS+10 m/L姜黄素,含1‰DMSO）。（4）高剂量组（DMEM+10%FBS+12.5 m/L姜黄素,含1‰DMSO）。（5）E.无诱导剂组：即原代角膜基质细胞组（DMEM,含1‰DMSO）。每3天换液一次,培养周期为7 d。药物分别作用7天后,应用RT-PCR法,分别提取以上五组细胞的RNA,并进行反转录获取cDNA。PCR扩增相关的细胞标志性基因：角膜蛋白多糖（keratocan）、醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）、CD90、decorin、fibronectin-1（引物见表1）。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后成像。观察不同质量浓度姜黄素作用下各细胞表型表达的变化趋势。3将原代角膜基质细胞以5×104个/ml接种于96孔板中,以上述A、B、C、D组培养液作用7d后,每孔加入新配制的MTS 20μl（5g/L）,4 h后弃去上清,用酶联免疫检测仪在490 nm波长测定各孔的吸光度值（A490）。每组设平行复孔6个,重复实验3次。计算上述各组中姜黄素对角膜基质细胞增生的抑制率（%）=（1-实验组A490/对照组A490）×100%,并进行比较。上述实验组在进行药物干预前均用锥虫蓝染色,对活细胞率进行检测,以观察姜黄素的细胞毒性。4角膜标本取出后立即经OCT包埋并切片（厚度为5μm）,冷丙酮固定10 min后风干,PBS冲洗3次,10%山羊血清封闭40 min,以兔抗鼠fibronectin-1抗体（1：50）4℃孵育过夜后用PBS冲洗3次,荧光素标记山羊抗兔IgG于37℃孵育30 min后用PBS冲洗3次,Hoechest33442（1：500）孵育1 min后用PBS冲洗,防褪色封片剂封片。以PBS代替兔抗鼠fibronectin-1抗体,作为阴性对照。应用荧光显微镜进行观察。5实验数据应用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果：1小鼠角膜基质细胞的形态学特征以及鉴定小鼠角膜基质经胶原酶消化后离心,可得到单个细胞。光学显微镜下观察原代角膜基质细胞,可见其胞体较小,呈圆形或多角形,并伸展出细长的突触,呈现出典型的树状骨针样、类似于神经元的形态学特征。2 RT-PCR法检测结果显示,小鼠角膜基质细胞keratocan和ALDH呈高表达,decorin呈低表达,不表达CD90；角膜基质成纤维细胞高表达CD90和decorin,低表达ALDH,不表达keratocan。随着加入姜黄素质量浓度的递增,上述实验组中keratocan和ALDH的mRNA表达量逐渐升高,CD90和decorin的mRNA表达量逐渐降低,均呈明显的剂量一效应依赖关系,与各自对照组相比且组间相比差异均有统计学意义（F=210.78,F=292.57, F=1194.79, F=736.48, P<0.05）。小鼠角膜基质细胞和角膜基质成纤维细胞均高表达fibronectin-1,但随着质量姜黄素浓度的升高,fibronectin-1的mRNA表达量无明显变化,与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）3 MTS法检测结果表明,随着姜黄素质量浓度的递增,其对角膜基质细胞增生的抑制率逐渐增加,各组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。锥虫蓝染色显示各组活细胞率均在90%以上,各组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。4免疫荧光技术检测发现角膜基质细胞表达fibronectin-1结论：姜黄素对离体小鼠角膜基质细胞纤维化有明显的抑制作用,可减轻角膜基质创伤修复过程中的过度纤维化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 姜黄素的研究进展及在眼科临床的应用
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历