CTC菌株的分类鉴定与S-层基因的表达载体构建

论文摘要

本研究内容包括两个方面,一方面运用16S-23S rRNA间隔区序列比较的方法完成了CTC菌株的系统发育学分类,将CTC菌株鉴定为蜡状芽胞杆菌;另一方面分别将木室克隆的编码S-层蛋白的基因ctc1和ctc2单独或聚合连接到穿梭质粒载体pHT304上,可以用于功能分析。 本室分离的CTC菌株,按照现行的表型分类法被巴斯德研究所鉴定为苏云金芽胞杆菌幕虫亚种,血清型为H2。然而,随后的研究中表明,CTC菌株虽然可以形成伴胞晶体,但形成的晶体很不稳定,而且,其晶体蛋白组成与普通的苏云金芽胞杆菌不同,并不是由质粒携带的cry系列的基因编码,而是染色体上编码S-层基因的产物,且伴胞晶体蛋白没有检测到对昆虫的毒性。因此,我们对其真实的属性和表型分类的可靠性产生了怀疑。运用目前国际系统发育分类学上的新热点技术——16S-23S rRNA间隔区序列比较的方法,选择了一定的菌株组合进行测序,从系统发育水平上找到CTC菌株的相对准确分类学地位。通过设计特异引物,PCR扩增出组合中7个候选菌并将PCR产物克隆进载体然后进行测序,一方面比较7株菌间的序列差异,同时通过检索核酸数据库,收集了其它来源的序列进行聚类分析。其结果表明,CTC菌株16S rRNA-23S rRNA间隔区序列与苏云金芽胞杆菌幕虫亚种代表菌T02的序列同源性在参比菌中最低,明显不属于同一类型,与巴斯德研究所运用表型分类法的结果不一致。进一步利用23S rRNA的部分序列或编码S层基因的序列进行聚类分析,CTC菌株以及T02菌株在分类的结果上同来自其它来源的苏云金芽胞杆菌并没有完全归为一处,而是介于苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌之间。因此,结合目前已经证实该菌株伴胞晶体由S层基因编码,且对昆虫无毒性的特点,我们认为CTC菌株属于蜡状芽胞杆菌,而且其可能处于蜡状芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌之间,与伴胞晶体形成的过渡类型遥相呼应,具有重要的研究价值。 S-层是位于原核细胞外壳最外层的一种表膜亚单位结构,呈晶格状排列,在原核细胞中分布广泛。S-层是由完全相同的亚单位组装成的单分子晶格点阵结构,它的二维晶格亚单位又是由单一的糖蛋白装配而成,在结构上有高度的规则性,代表了一种在进化中最简单的生物膜的发生模型。但是人们在研究中发现S-层在实验室适宜的生长环境中很容易丢失掉,而在自然界有竞争的环境下则不被丢失。就目前人们的研究结果来看,人们对S-层的统一认识中的一点就是它是存在于细胞的表面。而本实验室却发现了CTC菌的S-层与众不同,不仅在其表层有S-层的存在,而且该菌的晶体完全是由S-层蛋白组成。也就是说,该菌中的S-层不仅以表膜亚单位的结构存在于细胞表面而且以晶体的形态存在于细胞内,而在该菌中也已克隆到两个S-层蛋白编码基因,这两个基因与炭疽芽胞杆菌中的两个S-层基因有非常高的同源

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 细菌分类的常规方法
• 1.1.1 细菌分类的意义
• 1.1.2 细菌分类方法介绍
• 1.1.2.1 常规研究方法介绍
• 1.1.2.1.1 形态学特征
• 1.1.2.1.2 生理生化特征
• 1.1.2.1.3 生态学特征
• 1.1.2.1.4 抗原特征
• 1.1.2.2 化学分类法
• 1.1.2.3 数值分类法
• 1.1.2.4 遗传型分类法
• 1.1.2.4.1 质粒图谱分析法
• 1.1.2.4.2 限制性核酸内切酶分析法和脉冲场凝胶电泳分析法
• 1.1.2.4.3 核酸杂交法
• 1.1.2.4.4 PCR指纹图分析法
• 1.1.2.4.5 核酸序列分析法
• 1.1.2.4.6 ISR-PCR法在细菌分类研究上的应用
• 1.1.3 蜡状芽胞杆菌群间的相互关系
• 1.1.4 芽胞杆菌属间分类的研究进展
• 1.2 S层基因的研究现状
• 1.2.1 S-层发生，结构与装配
• 1.2.1.1 S-层发生
• 1.2.1.2 S-层的结构
• 1.2.1.3 S-层的装配
• 1.2.2 S-层蛋白与基因
• 1.2.3 S-layers蛋白与其下细胞外壳的附着
• 1.2.4 CTC菌株编码S层基因的研究进展
• 1.3 研究背景、目的和意义
• 1.3.1 菌株分类结果的验证实验
• 1.3.2 S层基因载体的构建实验
• 2 材料和方法
• 2.1 CTC菌株的分类鉴定实验
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 菌株和培养基
• 2.1.1.1.1 菌株
• 2.1.1.1.2 培养基
• 2.1.1.2 试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 生理生化
• 2.1.2.2 细菌总DNA的提取
• 2.1.2.3 引物的设计与PCR反应条件
• 2.1.2.4 PCR产物的纯化与克隆
• 2.1.2.5 电转化感受态的制备与电转化
• 2.1.2.6 质粒的抽提
• 2.1.2.7 重组子的鉴定
• 2.1.2.8 DNA测序
• 2.1.2.9 网络序列收集以及序列的软件分析
• 2.2 S层基因载体的构建实验
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌株
• 2.2.1.2 质粒
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 质粒的提取和酶切检测和DNA纯化和载体去磷酸化
• 2.2.2.2 质粒的转化
• 2.2.2.3 ctc1基因穿梭载体的构建
• 2.2.2.4 ctc2基因穿梭载体的构建
• 2.2.2.5 ctc1-ctc2基因穿梭载体载体构建
• 3 结果与分析
• 3.1 CTC菌株的分类鉴定
• 3.1.1 生理生化反应的结果
• 3.1.2 特异基因的PCR和指纹图谱分析
• 3.1.3 ISR-PCR反应和克隆测序
• 3.1.4 网络序列的收集
• 3.1.5 本研究提供的序列结果
• 3.1.5.1 ISR序列的MEGA的分析结果
• 3.1.5.2 利用网络序列聚类分析结果
• 3.1.5.3 根据编码S层蛋白基因的序列分析结果
• 3.1.6 Cluster分析及结果
• 3.2 CTC菌株中编码S层基因的载体构建
• 3.2.1 ctc1基因穿梭载体的构建
• 3.2.2 ctc2基因穿梭载体的构建
• 3.2.3 ctc1-ctc2基因穿梭载体构建
• 4 讨论
• 4.1 CTC菌株的分类鉴定
• 4.2 编码S层基因的载体构建
• 4.2.1 质粒的稳定性
• 4.2.2 S层基因对细菌生理的影响
• 4.2.3 关于实验中的改进
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 致谢