紫球藻藻红蛋白基因的克隆及表达

论文摘要

藻红蛋白可作为天然色素应用于食品和化妆品工业,还可以作为光敏剂和荧光探针广泛应用于医药行业。本论文主要从紫球藻（Porphyridium cruentum）藻红蛋白亚基基因的克隆,该亚基基因在巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌BL21中进行异源表达等方面开展研究。主要实验结果如下：在本课题组吴义诚已克隆出藻红蛋白β亚基的基础上,利用LA-PCR技术扩增出紫球藻藻红蛋白β、α亚基及间隔区序列（GenBank登录号：HM535635）,cDNA序列长1134 bp个碱基,包括p亚基编码区的534个碱基（编码177个氨基酸）,105个碱基的间隔区以及a亚基编码区495个碱基（编码164个氨基酸）。cDNA序列排布顺序为5’UTR-peB-间隔区-peA,对其基因组结构分析表明,藻红蛋白（Phyeoerythrin, PE）亚基基因编码区无内含子序列。利用生物信息学的方法对α亚基的氨基酸序列,氨基酸组成,疏水作用,二级结构和三级结构等方面进行了初步的分析和预测。结果显示,预测的藻红蛋白α亚基结构与不同来源的藻红蛋白α亚基结构十分吻合,同时它的结构特征也满足于捕光蛋白的特性。藻红蛋白α、p亚基分别亚克隆到毕赤酵母表达系统pPIC9K和大肠杆菌表达载体pET28a进行异源表达。重组的毕赤酵母表达载体pAO815-peA-peB、pPIC9K-peA分别转入Pichia pastoris GS 115,经甲醇诱导,SDS-PAGE电泳及DOT-BLOT分析,发现表达量过低。将藻红蛋白α、β亚基分别克隆到pET28a载体上,再分别转入E. coli BL21, IPTG诱导,WesternBlot分析有单一的条带出现,结果显示藻红蛋白α、β亚基在大肠杆菌表达系统中主要以包涵体的形式存在。对peB的密码子偏好进行了分析,结果表明peB在密码子使用上存在显著的偏好性,偏爱于使用以A或T结尾的密码子。将藻红蛋白亚基基因与大肠杆菌、毕赤酵母基因组的密码子偏爱性进行比较,结果表明,藻红蛋白亚基基因密码子用法与大肠杆菌、毕赤酵母差异较大,若要实现该基因在以上宿主中的高效表达则需对部分密码子进行改造。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 目录
• 绪论
• 第一节 课题背景
• 1.1 紫球藻简介
• 1.2 藻胆蛋白
• 第二节 藻红蛋白基本性质
• 2.1 藻红蛋白分类与命名
• 2.2 藻红蛋白分子组成
• 2.3 藻红蛋白的聚集形态及空间结构
• 2.4 藻红蛋白物理性质
• 第三节 藻红蛋白分子生物学
• 3.1 藻红蛋白脱辅基基因
• 3.2 藻红蛋白脱辅基基因结构
• 3.3 藻红蛋白脱辅基基因序列特征
• 3.4 藻红蛋白的生物合成
• 3.5 藻红蛋白的基因克隆及表达
• 第四节 藻红蛋白作用
• 4.1 藻红蛋白在藻体生理过程中的作用
• 4.2 藻红蛋白的应用
• 第五节 本课题研究的目的和意义
• 第一章 紫球藻藻红蛋白基因克隆
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 藻种和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要培养基及试剂配制
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 藻的培养
• 1.2.2 紫球藻基因组DNA提取
• 1.2.3 藻红蛋白基因a亚基的克隆
• 1.2.4 重组子的筛选和鉴定
• 1.2.5 序列的测定与分析
• 第二节 结果与分析
• 2.1 LA-PCR扩增
• 2.2 重组子的筛选及鉴定
• 2.3 LA-PCR产物序列测定与序列分析
• 2.4 藻红蛋白α亚基聚类分析
• 2.5 信号肽预测
• 2.6 理化表征分析
• 2.7 疏水性和跨膜分析
• 2.8 空间结构分析
• 第三节 小结与讨论
• 第二章 藻红蛋白亚基在毕赤酵母中表达
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果与分析
• 2.1 目的基因peA与peB的扩增
• 2.2 重组表达质粒的构建
• 2.3 重组毕赤酵母工程菌的构建
• 2.4 毕赤酵母工程菌的诱导表达
• 2.5 mRNA水平检测表达情况
• 第三节 小结与讨论
• 第三章 藻红蛋白亚基在大肠杆菌中表达
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果与分析
• 2.1 目的基因peA与peB的扩增
• 2.2 重组表达质粒的构建
• 2.3 重组E.coli BL21工程菌的构建
• 2.4 E coli BL21工程菌的诱导表达
• 第三节 小结与讨论
• 第四章 藻红蛋白基因密码子偏好性分析
• 第一节 材料与方法
• 1.1 序列数据与软件
• 1.2 方法
• 第二节 结果与分析
• 2.1 有效密码子数（ENC）和GC含量分析
• 2.2 密码子偏好性分析
• 2.3 紫球藻藻红蛋白基因与大肠杆菌、毕赤酵母的密码子偏好性比较
• 第三节 小结与讨论
• 第五章 结论
• 附录1
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历