论文摘要
鸡大肠杆菌病是一种由大肠埃希氏菌为原发性或继发性病原体所致鸡的一类疾病的总称。十二世纪中期以后,随着养鸡业的发展,鸡大肠杆菌病的危害日趋严重,特别是在鸡的几种重要病毒病得到有效控制后,由其造成的损失明显上升,该病已成为危害养鸡业的主要细菌病之一。本文分别对本实验室保存的四株鸡致病性大肠杆菌进行了形态学、生理生化鉴定以及药敏实验、毒力实验的研究,又将此四株菌株按照适当的比例制备了大肠杆菌多价灭活疫苗,所制菌苗产生免疫力较早,免疫保护期较长,具有较好的免疫原性。然后,以这四株菌株为研究对象,根据GenBank公布的致病性鸡大肠杆菌的I型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列,分别设计了两对引物,经PCR特异性扩增出pilA基因和OmpC基因,序列分析表明扩增得到的基因与其参考菌株序列高度同源。进而,将扩增得到的两个基因分别定向克隆到原核表达载体pET-28a中,得到两个重组质粒pETpilA和pETOmpC,转化致受体大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌株BL21(DE3)(pETpilA)和BL21(DE3)(pETOmpC),经IPTG诱导后,由SDS-PAGE分析分别可见表达的20Ku和40.9Ku的特异蛋白条带;Westernblot检测说明表达的蛋白具有较好的反应原性。又对已构建的基因工程菌株BL21(DE3)(pET-pilA)和BL21(DE3)(pET-OmpC),分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等方面进行诱导条件的优化,结果显示菌株BL21(DE3)(pET-pilA)在40℃,接菌量80μl,诱导时机2h,IPTG浓度为0.96mM,诱导时间4h时得到最大蛋白表达量,而菌株BL21(DE3)(pET-OmpC)的最佳诱导条件为诱导温度37℃,接菌量80μl,诱导时机2.5h,IPTG浓度为0.64mM,诱导时间7h。最后,将表达菌毛pilA蛋白和外膜蛋白C的菌株分别制成基因工程疫苗并进行初步的免疫原性研究,免疫小鼠后,保护能力分别达80%和60%,混合疫苗的保护力尤佳,高达100%。表明这两种基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株,为进一步研制预防鸡大肠杆菌病的基因工程疫苗奠定了坚实的基础。
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摘要ABSTRACT绪论1 文献综述1.1 鸡大肠杆菌病的发病特点1.2 鸡大肠杆菌病病因和致病因子1.2.1 鸡大肠杆菌病病原1.2.2 鸡大肠杆菌病的致病因子1.2.2.1 菌毛蛋白1.2.2.2 毒素的致病作用1.2.2.3 内毒素1.2.2.4 热敏肠毒素(LT)和Vero 毒素1.2.2.5 外膜蛋白(Omp)1.2.2.6 铁转运系统1.2.2.7 C01V 质粒1.3 鸡大肠杆菌病的防治1.3.1 一般性防治措施1.3.2 药物的应用1.3.2.1 一般药物防治1.3.2.2 中草药防治1.3.3 抗病育种1.3.4 研制菌苗免疫1.3.4.1 活菌苗免疫1.3.4.2 灭活苗免疫1.3.4.3 抗原提取苗免疫1.3.4.4 基因工程疫苗防治2 大肠杆菌的分离鉴定、药敏和致病力实验2.1 材料与方法2.1.1 材料2.1.1.1 病料2.1.1.2 培养基和试剂2.1.1.3 供试动物2.1.2 方法2.1.2.1 病原菌的分离和培养2.1.2.2 病原菌的鉴定2.1.2.2.1 细菌形态观察2.1.2.2.2 三糖铁琼脂生化试验2.1.2.2.3 微量生化试验2.1.2.2.4 血清型鉴定试验2.1.2.3 致病力试验2.1.2.4 药物敏感试验2.2 结果与分析2.2.1 病原菌的分离结果2.2.2 病原菌的鉴定结果2.2.2.1 细菌镜检结果2.2.2.2 克氏三糖铁生化试验结果2.2.2.3 微量生化试验鉴定结果2.2.2.4 血清型鉴定结果2.2.3 药敏试验结果2.2.4 致病力实验结果2.3 小结3 鸡致病性大肠杆菌多价灭活苗的研制3.1 材料与方法3.1.1 材料3.1.1.1 菌种3.1.1.2 培养基和试剂3.1.1.3 供试动物3.1.2 方法3.1.2.1 动物接种试验3.1.2.2 肠毒素鉴定3.1.2.3 制备攻毒菌液3.1.2.4 鸡大肠杆菌灭活苗的制备与检验3.1.2.4.1 菌种增殖3.1.2.4.2 纯粹检验3.1.2.4.3 活菌计数3.1.2.4.4 菌悬液的制备3.1.2.4.5 灭活3.1.2.4.6 无菌检验3.1.2.4.7 菌苗制备3.1.2.4.8 安全检验3.1.2.4.9 效力试验3.1.2.4.10 保存期试验3.2 结果与分析3.2.1 动物接种试验3.2.2 肠毒素鉴定3.2.3 纯粹检验和活菌计数3.2.4 鸡大肠杆菌灭活苗的实验室检验3.2.4.1 无菌检验3.2.4.2 安全检验3.2.4.3 稳定性测定3.2.4.4 免疫剂量3.2.4.5 效力检验3.2.4.6 免疫期试验3.2.5 保存期试验3.3 小结4 鸡大肠杆菌I 型菌毛PILA 基因和外膜蛋白C 基因的克隆和序列分析4.1 材料和方法4.1.1 材料4.1.1.1 菌株与质粒4.1.1.2 酶和试剂4.1.2 方法4.1.2.1 引物的设计与合成4.1.2.2 琼脂糖凝胶电泳4.1.2.3 I 型菌毛pilA 基因和外膜蛋白C 基因PCR 产物的回收4.1.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备4.1.2.5 I 型菌毛pilA 基因和外膜蛋白C 基因PCR 产物的连接反应4.1.2.6 大肠杆菌的转化4.1.2.7 质粒的小量制备4.1.2.8 重组子的筛选和酶切鉴定4.1.2.9 质粒DNA 的定量技术4.1.2.10 I 型菌毛基因和外膜蛋白基因的序列测定与同源性分析4.2 结果与分析4.2.1 I 型菌毛pilA 基因的克隆及测序结果4.2.1.1 I 型菌毛pilA 基因的PCR 扩增结果4.2.1.2 I 型菌毛pilA 基因重组质粒的酶切鉴定4.2.1.3 阳性重组子所含I 型菌毛基因的序列测定与同源性比较4.2.2 外膜蛋白C 基因的克隆及测序结果4.2.2.1 外膜蛋白C 基因的PCR 扩增结果4.2.2.2 外膜蛋白C 基因重组质粒的酶切鉴定4.2.2.3 阳性重组子所含外膜蛋白C 基因的序列测定与同源性比较4.3 小结5 鸡大肠杆菌I 型菌毛PILA 基因和外膜蛋白C 基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达5.1 材料与方法5.1.1 材料5.1.1.1 菌株与质粒5.1.1.2 酶和试剂5.1.2 方法5.1.2.1 含目的基因的重组质粒pUCmT-pilA,pUCmT-OmpC 及表达载体质粒pET-28a 的提取与纯化(方法同前)5.1.2.2 目的片段及表达载体质粒的酶切5.1.2.3 酶切后目的片段及载体的回收,连接和转化5.1.2.4 阳性重组子的筛选和鉴定(方法同前)5.1.2.5 二价基因工程菌株的构建5.1.2.6 重组菌株的诱导表达5.1.2.7 表达产物的SDS-PAGE 检测5.1.2.8 表达产物在大肠杆菌细胞中的分布5.1.2.9 表达产物的Western blot 分析5.2 结果与分析1I 型菌毛 pilA 基因重组质粒的酶切鉴定'>5.2.1 鸡大肠杆菌 O1I 型菌毛 pilA 基因重组质粒的酶切鉴定1外膜蛋白 C 基因重组表达质粒的酶切鉴定'>5.2.2 鸡大肠杆菌 O1外膜蛋白 C 基因重组表达质粒的酶切鉴定5.2.3 二价基因工程融合质粒的构建5.2.4 表达产物的SDS-PAGE 检测5.2.5 表达产物在大肠杆菌中的分布5.2.6 表达产物的Western blot 检测5.3 小结6 鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株诱导条件的优化6.1 材料和方法6.1.1 材料6.1.1.1 菌株6.1.1.2 试剂6.1.2 方法6.1.2.1 菌株的活化6.1.2.2 诱导条件的优化6.1.2.2.1 温度6.1.2.2.2 接菌量6.1.2.2.3 诱导时机6.1.2.2.4 IPTG 浓度6.1.2.2.5 诱导时间6.1.2.3 制蛋白样6.1.2.4 SDS-PAGE 检测6.1.2.5 蛋白表达量的测定6.2 结果6.2.1 SDS-PAGE 结果6.2.2 蛋白含检测量结果6.3 小结7 鸡大肠杆菌病基因工程菌株的保护性实验7.1 材料与方法7.1.1 材料7.1.1.1 实验动物7.1.1.2 试剂7.1.1.3 器械7.1.1.4 载玻片的清洗7.1.1.5 多聚甲醛固定液的配制7.1.1.6 苏木精染液的配制7.1.1.7 伊红染液的配制7.1.1.8 蛋白甘油粘贴剂的配制7.1.2 方法7.1.2.1 疫苗的制备7.1.2.2 攻毒菌株的复壮7.1.2.3 保护性实验7.1.2.4 ELISA7.1.2.5 石蜡切片7.1.2.5.1 组织取材、固定、脱水和石蜡包埋流程7.1.2.5.2 组织切片、H-E 染色流程7.1.2.6 鸡体效力实验7.2 结果与分析7.2.1 基因工程菌株安全性实验7.2.2 疫苗的安全性检验7.2.3 间接ELISA 检测小鼠抗血清结果7.2.4 基因工程菌株的小鼠免疫保护试验结果7.2.5 鸡体免疫实验7.3 小结讨论结论参考文献附录攻读学位期间取得的科研成果清单
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标签:鸡致病性大肠杆菌论文; 多价灭活苗论文; 基因工程菌论文;
鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株的构建及其免疫原性的研究
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