鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株的构建及其免疫原性的研究

论文摘要

鸡大肠杆菌病是一种由大肠埃希氏菌为原发性或继发性病原体所致鸡的一类疾病的总称。十二世纪中期以后,随着养鸡业的发展,鸡大肠杆菌病的危害日趋严重,特别是在鸡的几种重要病毒病得到有效控制后,由其造成的损失明显上升,该病已成为危害养鸡业的主要细菌病之一。本文分别对本实验室保存的四株鸡致病性大肠杆菌进行了形态学、生理生化鉴定以及药敏实验、毒力实验的研究,又将此四株菌株按照适当的比例制备了大肠杆菌多价灭活疫苗,所制菌苗产生免疫力较早,免疫保护期较长,具有较好的免疫原性。然后,以这四株菌株为研究对象,根据GenBank公布的致病性鸡大肠杆菌的I型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列,分别设计了两对引物,经PCR特异性扩增出pilA基因和OmpC基因,序列分析表明扩增得到的基因与其参考菌株序列高度同源。进而,将扩增得到的两个基因分别定向克隆到原核表达载体pET-28a中,得到两个重组质粒pETpilA和pETOmpC,转化致受体大肠杆菌BL21（DE3）中,得到重组菌株BL21（DE3）（pETpilA）和BL21（DE3）（pETOmpC）,经IPTG诱导后,由SDS-PAGE分析分别可见表达的20Ku和40.9Ku的特异蛋白条带;Westernblot检测说明表达的蛋白具有较好的反应原性。又对已构建的基因工程菌株BL21（DE3）（pET-pilA）和BL21（DE3）（pET-OmpC）,分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等方面进行诱导条件的优化,结果显示菌株BL21（DE3）（pET-pilA）在40℃,接菌量80μl,诱导时机2h,IPTG浓度为0.96mM,诱导时间4h时得到最大蛋白表达量,而菌株BL21（DE3）（pET-OmpC）的最佳诱导条件为诱导温度37℃,接菌量80μl,诱导时机2.5h,IPTG浓度为0.64mM,诱导时间7h。最后,将表达菌毛pilA蛋白和外膜蛋白C的菌株分别制成基因工程疫苗并进行初步的免疫原性研究,免疫小鼠后,保护能力分别达80%和60%,混合疫苗的保护力尤佳,高达100%。表明这两种基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株,为进一步研制预防鸡大肠杆菌病的基因工程疫苗奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 绪论
• 1 文献综述
• 1.1 鸡大肠杆菌病的发病特点
• 1.2 鸡大肠杆菌病病因和致病因子
• 1.2.1 鸡大肠杆菌病病原
• 1.2.2 鸡大肠杆菌病的致病因子
• 1.2.2.1 菌毛蛋白
• 1.2.2.2 毒素的致病作用
• 1.2.2.3 内毒素
• 1.2.2.4 热敏肠毒素（LT）和Vero 毒素
• 1.2.2.5 外膜蛋白（Omp）
• 1.2.2.6 铁转运系统
• 1.2.2.7 C01V 质粒
• 1.3 鸡大肠杆菌病的防治
• 1.3.1 一般性防治措施
• 1.3.2 药物的应用
• 1.3.2.1 一般药物防治
• 1.3.2.2 中草药防治
• 1.3.3 抗病育种
• 1.3.4 研制菌苗免疫
• 1.3.4.1 活菌苗免疫
• 1.3.4.2 灭活苗免疫
• 1.3.4.3 抗原提取苗免疫
• 1.3.4.4 基因工程疫苗防治
• 2 大肠杆菌的分离鉴定、药敏和致病力实验
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 病料
• 2.1.1.2 培养基和试剂
• 2.1.1.3 供试动物
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 病原菌的分离和培养
• 2.1.2.2 病原菌的鉴定
• 2.1.2.2.1 细菌形态观察
• 2.1.2.2.2 三糖铁琼脂生化试验
• 2.1.2.2.3 微量生化试验
• 2.1.2.2.4 血清型鉴定试验
• 2.1.2.3 致病力试验
• 2.1.2.4 药物敏感试验
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 病原菌的分离结果
• 2.2.2 病原菌的鉴定结果
• 2.2.2.1 细菌镜检结果
• 2.2.2.2 克氏三糖铁生化试验结果
• 2.2.2.3 微量生化试验鉴定结果
• 2.2.2.4 血清型鉴定结果
• 2.2.3 药敏试验结果
• 2.2.4 致病力实验结果
• 2.3 小结
• 3 鸡致病性大肠杆菌多价灭活苗的研制
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 菌种
• 3.1.1.2 培养基和试剂
• 3.1.1.3 供试动物
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 动物接种试验
• 3.1.2.2 肠毒素鉴定
• 3.1.2.3 制备攻毒菌液
• 3.1.2.4 鸡大肠杆菌灭活苗的制备与检验
• 3.1.2.4.1 菌种增殖
• 3.1.2.4.2 纯粹检验
• 3.1.2.4.3 活菌计数
• 3.1.2.4.4 菌悬液的制备
• 3.1.2.4.5 灭活
• 3.1.2.4.6 无菌检验
• 3.1.2.4.7 菌苗制备
• 3.1.2.4.8 安全检验
• 3.1.2.4.9 效力试验
• 3.1.2.4.10 保存期试验
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 动物接种试验
• 3.2.2 肠毒素鉴定
• 3.2.3 纯粹检验和活菌计数
• 3.2.4 鸡大肠杆菌灭活苗的实验室检验
• 3.2.4.1 无菌检验
• 3.2.4.2 安全检验
• 3.2.4.3 稳定性测定
• 3.2.4.4 免疫剂量
• 3.2.4.5 效力检验
• 3.2.4.6 免疫期试验
• 3.2.5 保存期试验
• 3.3 小结
• 4 鸡大肠杆菌I 型菌毛PILA 基因和外膜蛋白C 基因的克隆和序列分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 菌株与质粒
• 4.1.1.2 酶和试剂
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 引物的设计与合成
• 4.1.2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 4.1.2.3 I 型菌毛pilA 基因和外膜蛋白C 基因PCR 产物的回收
• 4.1.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.1.2.5 I 型菌毛pilA 基因和外膜蛋白C 基因PCR 产物的连接反应
• 4.1.2.6 大肠杆菌的转化
• 4.1.2.7 质粒的小量制备
• 4.1.2.8 重组子的筛选和酶切鉴定
• 4.1.2.9 质粒DNA 的定量技术
• 4.1.2.10 I 型菌毛基因和外膜蛋白基因的序列测定与同源性分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 I 型菌毛pilA 基因的克隆及测序结果
• 4.2.1.1 I 型菌毛pilA 基因的PCR 扩增结果
• 4.2.1.2 I 型菌毛pilA 基因重组质粒的酶切鉴定
• 4.2.1.3 阳性重组子所含I 型菌毛基因的序列测定与同源性比较
• 4.2.2 外膜蛋白C 基因的克隆及测序结果
• 4.2.2.1 外膜蛋白C 基因的PCR 扩增结果
• 4.2.2.2 外膜蛋白C 基因重组质粒的酶切鉴定
• 4.2.2.3 阳性重组子所含外膜蛋白C 基因的序列测定与同源性比较
• 4.3 小结
• 5 鸡大肠杆菌I 型菌毛PILA 基因和外膜蛋白C 基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 菌株与质粒
• 5.1.1.2 酶和试剂
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 含目的基因的重组质粒pUCmT-pilA，pUCmT-OmpC 及表达载体质粒pET-28a 的提取与纯化（方法同前）
• 5.1.2.2 目的片段及表达载体质粒的酶切
• 5.1.2.3 酶切后目的片段及载体的回收，连接和转化
• 5.1.2.4 阳性重组子的筛选和鉴定（方法同前）
• 5.1.2.5 二价基因工程菌株的构建
• 5.1.2.6 重组菌株的诱导表达
• 5.1.2.7 表达产物的SDS-PAGE 检测
• 5.1.2.8 表达产物在大肠杆菌细胞中的分布
• 5.1.2.9 表达产物的Western blot 分析
• 5.2 结果与分析
• 1I 型菌毛 pilA 基因重组质粒的酶切鉴定'>5.2.1 鸡大肠杆菌 O₁I 型菌毛 pilA 基因重组质粒的酶切鉴定
• 1外膜蛋白 C 基因重组表达质粒的酶切鉴定'>5.2.2 鸡大肠杆菌 O₁外膜蛋白 C 基因重组表达质粒的酶切鉴定
• 5.2.3 二价基因工程融合质粒的构建
• 5.2.4 表达产物的SDS-PAGE 检测
• 5.2.5 表达产物在大肠杆菌中的分布
• 5.2.6 表达产物的Western blot 检测
• 5.3 小结
• 6 鸡致病性大肠杆菌基因工程菌株诱导条件的优化
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 菌株
• 6.1.1.2 试剂
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 菌株的活化
• 6.1.2.2 诱导条件的优化
• 6.1.2.2.1 温度
• 6.1.2.2.2 接菌量
• 6.1.2.2.3 诱导时机
• 6.1.2.2.4 IPTG 浓度
• 6.1.2.2.5 诱导时间
• 6.1.2.3 制蛋白样
• 6.1.2.4 SDS-PAGE 检测
• 6.1.2.5 蛋白表达量的测定
• 6.2 结果
• 6.2.1 SDS-PAGE 结果
• 6.2.2 蛋白含检测量结果
• 6.3 小结
• 7 鸡大肠杆菌病基因工程菌株的保护性实验
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.1.1 实验动物
• 7.1.1.2 试剂
• 7.1.1.3 器械
• 7.1.1.4 载玻片的清洗
• 7.1.1.5 多聚甲醛固定液的配制
• 7.1.1.6 苏木精染液的配制
• 7.1.1.7 伊红染液的配制
• 7.1.1.8 蛋白甘油粘贴剂的配制
• 7.1.2 方法
• 7.1.2.1 疫苗的制备
• 7.1.2.2 攻毒菌株的复壮
• 7.1.2.3 保护性实验
• 7.1.2.4 ELISA
• 7.1.2.5 石蜡切片
• 7.1.2.5.1 组织取材、固定、脱水和石蜡包埋流程
• 7.1.2.5.2 组织切片、H-E 染色流程
• 7.1.2.6 鸡体效力实验
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 基因工程菌株安全性实验
• 7.2.2 疫苗的安全性检验
• 7.2.3 间接ELISA 检测小鼠抗血清结果
• 7.2.4 基因工程菌株的小鼠免疫保护试验结果
• 7.2.5 鸡体免疫实验
• 7.3 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间取得的科研成果清单