人β-淀粉样蛋白的原核表达、纯化及鉴定

论文摘要

近年来研究表明,β-淀粉样蛋白是构成阿尔茨海默病主要病理学改变的老年斑的主要成分,β-淀粉样蛋白形成斑块是疾病发生发展过程中的中心环节。为了更深入地研究β-淀粉样蛋白的特性,我们构建了人β-淀粉样蛋白的pGEX-4T-1-Aβ42重组质粒,在大肠杆菌原核表达系统中进行表达,并对表达的融合蛋白进行了纯化、鉴定、酶切以及酶切后β-淀粉样蛋白单体的初步生物学活性分析。从人神经瘤母细胞SH-SY5Y中提取总mRNA,通过反转得到与之互补的cDNA,参照基因库中Aβ42的基因序列和酶位点序列,设计了一对特异性引物,利用RT-PCR方法,扩增Aβ42基因,通过限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ分别对扩增产物和载体进行酶切,将目的基因定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建重组质粒pGEX-4T-1-Aβ42,对重组质粒进行双酶切等初步鉴定后并进行序列测定。结果显示,目的基因成功插入到pGEX-4T-1载体中,克隆得到的基因与GeneBank数据库中Aβ42的序列一致。为了提高Aβ42在大肠杆菌中的可溶性表达,我们考察了诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间以及超声条件等对大肠杆菌中可溶性GST-Aβ42融合蛋白表达及产率的影响。结果表明,大肠杆菌在37°C培养4 h后,以终浓度为1 mmol/L的IPTG在25°C下继续诱导培养2 h,可促进GST-Aβ42融合蛋白的可溶性表达;表达产物经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE表明融合蛋白分子量约为32 kD,与预期的GST-Aβ42分子量大小一致;Western Blot杂交进一步分析表明该融合蛋白能分别与GST抗体和Aβ42抗体反应,证实纯化得到的是GST-Aβ42融合蛋白。利用凝血酶对纯化后的GST-Aβ42融合蛋白进行酶切,酶切产物先后经Glutathione Sepharose 4B亲和柱和苯甲脒柱结合分别去除酶切下的GST蛋白和凝血酶,得到的产物通过Tricine-SDS-PAGE电泳,显示其分子量约为4.5 kD,与预期的Aβ42单体一致;Western Blot杂交显示该蛋白能与Aβ42抗体反应,而不与GST抗体反应,表明所得到的蛋白即为Aβ42。在此基础上,通过细胞增殖实验、Hoechst 33342-PI双染色和硫磺素-T荧光分析,老化后的重组Aβ42蛋白表现出较强的生物学聚集及细胞毒性特性。本研究的实验结果为大量生产重组人β淀粉样蛋白以及阿尔茨海默病的进一步基础及临床研究提供了物质和技术保障。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 阿尔茨海默病概况
• 1.2 β-淀粉样蛋白的生成
• 1.3 β-淀粉样蛋白的神经毒性
• 1.4 β-淀粉样蛋白引发的其他可能作用机制
• 1.4.1 β-淀粉样蛋白与氧化应激
• 1.4.2 β-淀粉样蛋白与炎症反应
• 1.4.3 β-淀粉样蛋白与细胞凋亡
• 1.5 目前针对β-淀粉样蛋白的AD 治疗方案
• 1.6 本课题开展的意义
• 42基因的克隆及表达载体的构建'>第二章 Aβ₄₂基因的克隆及表达载体的构建
• 2.1 绪言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 工具酶及菌株
• 2.2.2 试剂及试剂盒
• 2.2.3 培养基和细胞
• 2.2.4 主要仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 总m RNA 的提取和cDNA 的制备
• 2.3.2 RT-PCR
• 2.3.3 重组质粒pGEX-4T-1-Aβ42 的构建
• 2.3.4 重组质粒的序列测定
• 42-BL21 的制备'>2.3.5 表达载体pGEX-4T-1-Aβ₄₂-BL21 的制备
• 2.4 结果
• 2.4.1 总m RNA 的提取和cDNA 的制备
• 2.4.2 编码Aβ基因的克隆
• 42 的构建'>2.4.3 重组质粒pGEX-4T-1-Aβ₄₂的构建
• 2.4.4 重组质粒的序列测定
• 42-BL21 的构建'>2.4.5 表达载体pGEX-4T-1-Aβ₄₂-BL21 的构建
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 42融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定'>第三章 GST-Aβ₄₂融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
• 3.1 绪言
• 3.2 材料
• 3.2.1 药品与试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 方法
• 42 融合蛋白的诱导表达'>3.3.1 GST-Aβ₄₂融合蛋白的诱导表达
• 42 融合蛋白的诱导条件的优化'>3.3.2 GST-Aβ₄₂融合蛋白的诱导条件的优化
• 42 融合蛋白的分离纯化'>3.3.3 GST-Aβ₄₂融合蛋白的分离纯化
• 42 融合蛋白的SDS-PAGE 鉴定'>3.3.4 GST-Aβ₄₂ 融合蛋白的SDS-PAGE 鉴定
• 3.3.5 GST 酶活测定
• 42 融合蛋白的Western-bloting 鉴定'>3.3.6 GST-Aβ₄₂ 融合蛋白的Western-bloting 鉴定
• 3.4 结果
• 42 融合蛋白的诱导表达'>3.4.1 GST-Aβ₄₂融合蛋白的诱导表达
• 42 融合蛋白的诱导条件优化'>3.4.2 GST-Aβ₄₂融合蛋白的诱导条件优化
• 42 融合蛋白的分离纯化'>3.4.3 GST-Aβ₄₂融合蛋白的分离纯化
• 42 融合蛋白的SDS-PAGE 鉴定'>3.4.4 GST-Aβ₄₂ 融合蛋白的SDS-PAGE 鉴定
• 3.3.5 GST 酶活测定
• 42 融合蛋白的Western bloting 鉴定'>3.4.6 GST-Aβ₄₂ 融合蛋白的Western bloting 鉴定
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 42融合蛋白的酶切及Aβ₄₂活性初步测定'>第四章 GST-Aβ₄₂融合蛋白的酶切及Aβ₄₂活性初步测定
• 4.1 绪言
• 4.2 材料
• 4.2.1 材料和试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 方法
• 42 融合蛋白的酶切'>4.3.1 GST-Aβ₄₂融合蛋白的酶切
• 4.3.2 切割后目的蛋白的SDS-PAGE 鉴定
• 4.3.3 切割后目的蛋白的Tricine-SDS-PAGE 鉴定
• 4.3.4 Western blot 鉴定
• 42 单体的银染鉴定'>4.3.5 Aβ₄₂单体的银染鉴定
• 42 的HPLC 含量测定'>4.3.6 Aβ₄₂ 的HPLC 含量测定
• 42 的得率测定'>4.3.7 Aβ₄₂的得率测定
• 42 片段对SH-SY5Y 细胞增殖的影响'>4.3.8 Aβ₄₂ 片段对SH-SY5Y 细胞增殖的影响
• 42 诱导的细胞凋亡'>4.3.9 Hoechst 33342-PI 双染法测定Aβ₄₂诱导的细胞凋亡
• 42 聚集的硫磺素T 荧光分析'>4.3.10 Aβ₄₂ 聚集的硫磺素T 荧光分析
• 4.4 结果
• 42 的SDS-PAGE 鉴定'>4.4.1 Aβ₄₂ 的SDS-PAGE 鉴定
• 4.4.2 离柱酶切条件的优化
• 42 的Tricine-SDS-PAGE 鉴定'>4.4.3 Aβ₄₂ 的Tricine-SDS-PAGE 鉴定
• 42 的Western blot 鉴定'>4.4.4 Aβ₄₂ 的Western blot 鉴定
• 42 的的银染鉴定'>4.4.5 Aβ₄₂的的银染鉴定
• 42 的HPLC 含量测定'>4.4.6 Aβ₄₂ 的HPLC 含量测定
• 42 的得率测定'>4.4.7 Aβ₄₂的得率测定
• 42 对SH-SY5Y 细胞增殖的作用'>4.4.8 Aβ₄₂ 对SH-SY5Y 细胞增殖的作用
• 4.4.9 Hoechst 33342-PI 双染分析
• 4.4.10 Thioflavin-T 荧光分析
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 第五章 论文总结与展望
• 5.1 论文总结
• 5.2 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文