鼠疫耶尔森氏菌基因组多态性研究及快速鉴定溯源系统的建立

论文摘要

鼠疫是一种流行在啮齿动物间通过跳蚤传播的自然疫源性疾病,鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌）是鼠疫的病原菌,在历史上曾经引发三次世界范围的鼠疫大流行,给人类带来巨大的灾难。近年来,鼠疫在亚非地区的流行有增无减,动物间疫情呈活跃态势,鼠疫的防治仍是不容忽视的问题。另外,鼠疫菌也是生物武器缔约国专家组所确定的标准生物战剂,非常有可能应用于生物战和生物恐怖袭击,因此对鼠疫菌进行基因组多态性研究,建立多态性数据库,对疫情爆发和生物恐怖袭击发生时鼠疫菌的快速鉴定溯源具有非常重要的意义。鼠疫菌在进化过程中基因组不断发生变异以适应新的生态位,逐渐形成具有不同特点的鼠疫菌菌株。细菌基因组变异的主要分子策略包括点突变,基因的获得和缺失、基因重排和重复序列拷贝数变化,本研究针对各种基因组变异形式设计了不同的分子生物学实验方法,系统地考察了鼠疫菌基因组多态性,筛选出精简有效的的分子靶标,建立了中国鼠疫菌快速鉴定溯源系统。同时,通过大量数据分析,深入探讨了鼠疫菌的适应性进化以及与之密切相关的鼠疫自然疫源地形成与扩张过程。基于SNPs分析的鼠疫菌遗传关系框架的构建单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）是一种稳定的遗传标记,能够用来推测物种进化方向和进化年代,已经广泛应用于生物遗传关系的研究。本研究在Achtman等人研究的基础上,选择45个SNPs位点,对121株涵盖4个生物型,分离自不同疫源地和宿主的代表性菌株进行了分析,将其分成12个SNPs型,建立了基于45个SNPs的鼠疫菌遗传关系框架,将鼠疫菌分成3个进化分支,与假结核耶尔森氏菌相比,Branch 0中SNPs突变最少,认为是一个比较古老的分支,其中包括了0.PE4型的田鼠型菌株和较为古老的0.PE5和0.PE6型的古典型菌株;Branch 1分支中包括了1.ORI的东方型菌株和与之关系密切的1.ANT的古典型菌株;Branch 2分支中包括了2.MED的中世纪型菌株和与之关系密切的2.ANT的古典型菌株。该遗传关系框架的建立为使用其他遗传标记对鼠疫菌进行多态性研究提供了遗传关系上的参考。基于基因获得和缺失的鼠疫菌基因分型系统的完善在本实验室前期研究中,通过芯片比较基因组学分析和抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）在鼠疫菌基因组中鉴定出23个差异区段（Different region,DFR）,并对大量菌株进行了分析。本研究对前期获得的数据进行补充验证,对最终909株鼠疫菌的DFR数据进行全面系统的分析,完善了基于DFR中国鼠疫菌基因分型体系,将909株中国鼠疫菌代表株分成32个基因组型,同时提出了主要基因组型和次要基因组型的概念,主要基因组型呈明显的疫源地特异性,但是鉴于DFR分型方法分辨率低的局限性,仍存在不同疫源地的菌株具有同一基因组型的情况。通过与完成测序的鼠疫菌及假结核菌DFR谱的比较,我们得以在一定程度上探讨了中国与国外鼠疫菌的差异,得出一系列有意义的推论:基于减数进化的理论,本研究的结果显示中国的东方型菌株较国外的东方型菌株古老,支持了东方型菌株起源于中国的推论;新疆鼠疫菌的DFR谱呈现出高度的多态性,说明新疆是中国与中亚鼠疫菌频繁交换传播的通道。DFR分型方法操作简便,成本低廉,适用于大量菌株的快速分型,随着尽可能多的新DFR的鉴定,DFR分型方法会日臻完善。基于串联重复序列的鼠疫菌基因组多态性研究鼠疫菌是一类比较年轻的菌种,进化时间短,基因组中还没有积累足够多的变异,因此需要一种多态性高的遗传标记来区分近缘菌株。本研究采用高分辨率的MLVA（multi- locus VNTR analysis,多位点串联重复序列分析）方法,对鼠疫菌基因组中可变数目串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeat,VNTR）进行深入系统的研究。目前在鼠疫菌MLVA研究领域中有两套较为常用的位点,一套是法国第十一大学的Vergnaud博士实验室鉴定的25个位点,另一套是美国Arizona大学Keim博士实验室鉴定的42个位点。我们首先选择Vergnaud等人鉴定的适合琼脂糖凝胶电泳分析的25个位点,对383株中国代表性鼠疫进行分析,通过与法国和俄罗斯实验室的数据交流,将共计近500株来自中国、前苏联、蒙古及部分欧洲地区的鼠疫菌分成350个基因型。这25个位点分辨率高,能很好地区分DFR方法不能分开的来自L和M疫源地、G和H疫源地及I和K1疫源地菌株。综合国外数据,我们首次深入探讨了中国与国外菌株的关系,推测了鼠疫菌传播及自然疫源地扩张模式。由于方法学的局限性,25个VNTR位点的平均重复基序大小为17bp,不能够代表广泛分布于基因组中VNTR。在进一步的研究中,我们选择了94株具备SNP分析数据的代表性菌株对基于上述两套位点的分型聚类关系进行分析,发现与SNPs遗传关系框架相比,两套位点都存在一定的局限性。产生这种现象的原因可能是国外鼠疫菌菌型较单一,导致对VNTR位点选择有所偏差。本研究利用中国鼠疫菌资源丰富的优势对鼠疫菌基因组中的VNTR位点进行了系统的筛选,最终获得了18个多态性高,与SNPs框架相比能够较好反映鼠疫菌各组群聚类关系的位点,为鼠疫菌的快速鉴定溯源提供精简有效的分子靶标,同时研究中获取的近10万个基因组多态性数据大大丰富了本室前期建立的鼠疫菌基因组多态性数据库,为鼠疫菌的鉴定溯源提供了宝贵资料。基于插入序列的鼠疫菌基因分型方法的探索插入序列（Insertion Sequence, IS）是一种可移动的DNA元件,在转座酶的作用下可以从基因组中的一个位点转移到另一个位点,促进了基因组的重排、改变了基因的表达,是细菌基因组变异的主要动力之一。本研究对以前基于PCR的IS研究方法进行探讨,发现由于鼠疫菌基因组中插入序列重排情况非常复杂,仅仅依据PCR扩增结果阴性或阳性判定IS的插入状态会给分型结果造成偏差,影响系统发育关系的正确构建。本研究为今后IS在鼠疫菌基因组中的多态性研究积累了宝贵经验。中国鼠疫菌快速鉴定溯源系统的建立对本研究中所获得的大量数据进行综合分析,发现几种遗传标记在鼠疫菌基因组多态性研究中所起的作用各有千秋。SNPs作为一种稳定的遗传标记,能够准确地反映出鼠疫菌各组群之间的遗传关系,确定进化方向和进化时间,适合用于鼠疫菌的微进化研究,但分辨率差,成本较高,不利于作为一种常规检测手段普及应用。IS的研究仅依靠简单的PCR判断插入序列的有无大大降低了分辨率,难以获得准确可靠的结果。基于DFR的分型方法操作简便,重现性好,成本低廉,易于普及,但由于该方法分辨率不高,无法对所有鼠疫菌株进行准确的区分和溯源。多位点VNTR分析分辨率高,合理选择位点能正确反映菌株间的聚类关系,但操作较为繁琐耗时。综合DFR和MLVA方法的特点,本研究选用5个DFR位点和8个VNTR位点,建立了中国鼠疫菌快速鉴定溯源系统。借助鼠疫菌基因组多态性数据库及相关分析软件,可以将菌株定位到不同的地理位置。为将来疫情爆发或生物恐怖袭击发生时鼠疫菌的快速鉴定溯源提供了有力工具。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 前言
• 第一章 基于 SNPs 分析的鼠疫菌遗传关系框架的构建
• 1. 导论
• 2. 材料与方法
• 3. 结果与讨论
• 4. 小结
• 第二章 基于差异区段的鼠疫菌基因分型系统的完善
• 1. 导论
• 2. 材料与方法
• 3. 结果与讨论
• 4. 小结
• 第三章 基于串联重复序列的鼠疫菌基因组多态性研究
• 第一节 概述
• 第二节 基于25 个VNTR 位点的鼠疫菌基因组多态性的研究
• 1. 导论
• 2. 材料与方法
• 3. 结果与讨论
• 4. 小结
• 第三节 鼠疫菌全基因组 VNTR 位点筛选研究
• 1. 导论
• 2. 材料与方法
• 3. 结果与讨论
• 4. 小结
• 第四章 基于插入序列的鼠疫菌基因分型方法的探索
• 1. 导论
• 2. 材料与方法
• 3. 结果与讨论
• 4. 小结
• 第五章 中国鼠疫耶尔森氏菌快速鉴定溯源系统的建立
• 1. 导论
• 2. 鉴定溯源系统建立的基础
• 3. 鉴定溯源系统分子靶标的选择
• 4. 鉴定溯源系统使用方法及溯源流程
• 5. 小结
• 综述
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢