泛素相关蛋白Dcn1p的原核表达、纯化、晶体筛选及相互作用蛋白分析

论文摘要

泛素—蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）不仅是一种破坏陈旧或损坏蛋白质的重要机制之一，而且还参与调节细胞周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原呈递、细胞增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程，UPP的异常与诸多疾病有密切关系。酵母（S．cereviciae）蛋白Dcnlp参与了UPP途径中E3复合物SCF的Neddylation作用，并能促进此UPP途径底物的降解。本研究的内容包括：运用基因工程技术克隆Dcnlp蛋白基因至表达载体；运用原核表达技术获得表达大量可溶性的Dcnlp全长蛋白；经亲和层析、FPLC系统O柱及Sephadex G-200纯化全长蛋白；通过悬滴气象扩散法筛选蛋白晶体；在获知结构后，通过亲和层析和免疫印迹检测Dcnlp相互作用蛋白；采用表面等离子共振（SPR）进一步确定相互作用并获得结合常数。本研究的结论包括：1．获得了大量纯度达95％以上的Dcnlp蛋白；2．Dcnlp蛋白在100Mm Tris HCl（Ph8.5），30％PEGMME-5000，0.2M硫酸铵条件下获得了可用于数据收集并解析结构的晶体；3．在国内外首次获得Dcnlp蛋白晶体结构，分辨率为1.9A的晶体结构中包括第66—269位氨基酸残基的定位，符合正六面体空间排布，共由11个α—螺旋连接而成。4．在国内外首次提出并证实Rbxl同Dcnlp有弱相互作用，测得二者平衡结合常数KA=3.72×105M-1，进一步确定Dcnlp参与UPP以及Neddylaion途径，也为Dcnlp参与构成Neddylaion途径中E3复合物的推断提供了重要的新证据。本研究在结构分析的基础上探究Dcnlp的生物学功能，对Neddylation途径有了更为深入的了解，为泛素途径E3复合物SCF在细胞周期、有丝分裂中如何发挥作用提供新的依据和思路，对泛素途径相关的肿瘤、神经性疾病及炎症等疾病的研究具有重要的生物学意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 泛素途径研究概况
• 1.1.1 泛素途径的发现
• 1.1.2 泛素-蛋白酶体途径基本进程
• 1.1.3 泛素-蛋白酶体途径与疾病
• 1.1.4 参与泛素-蛋白酶体途径的酶类
• 1.2 DCN-1蛋白的研究概况
• 1.2.1 Neddylation途径修饰蛋白Cullin
• 1.2.2 Neddylation途径基本进程
• 1.2.3 Neddylation途径同泛素-蛋白酶途径的关系
• 1.2.4 Neddylation途径相关蛋白DCN-1的研究进展
• 1.3 蛋白质结构研究方法
• 1.3.1 克隆和表达载体
• 1.3.2 蛋白质表达
• 1.3.3 蛋白质纯化
• 1.3.4 高通量蛋白质结晶（high-throughput protein crystallization）
• 1.3.5 晶体的收获和储存
• 1.3.6 同步加速器线束的数据收集
• 1.4 相互作用分子的检测方法
• 1.4.1 亲和层析及免疫印迹检测
• 1.4.2 表面等离子共振（SPR）法
• 1.5 本研究的目的意义及方法
• 1.5.1 研究内容及方法
• 1.5.2 研究目的及意义
• 第二章 载体构建及融合蛋白的表达纯化
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组质粒PGEX-4T-2-Dcn1P的构建
• 2.2.2 融合蛋白的表达及纯化
• 2.3 讨论
• 第三章 DCN1P蛋白晶体的筛选及优化
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 Dcn1P蛋白晶体的初筛
• 3.2.2 Dcn1P蛋白晶体的优化
• 3.2.3 Dcn1P蛋白晶体重原子浸泡
• 3.3 讨论
• 第四章 与DCN1P相互作用蛋白检测
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 推测相互作用蛋白与Dcn1p的亲和层析与免疫印迹检测
• 4.2.2 Rbx1同Dcn1p结合关系的表面等离子共振（SPR）检测
• 4.2.3 Rbx1同Dcn1p结合关系的定量实验
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介