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蚯蚓非编码小RNA的克隆与鉴定

2020-12-07阅读(596)

蚯蚓非编码小RNA的克隆与鉴定

论文摘要

microRNA（miRNA）是一种非常重要的非编码小RNA,它的长度一般为20～25个核苷酸（nt）,广泛存在于真核生物中,主要起基因转录后水平的负调控作用。成熟的miRNA是由约70～90个碱基、具发夹结构的单链RNA前体（pre-miRNA）经过Dicer酶加工而成,然后通过与靶基因完全互补结合或不完全互补结合,进而降解靶基因或抑制翻译来调控靶基因的表达。作为重要的调节分子,miRNA参与各种各样的调节途径,包括细胞的生长和分化、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢和肿瘤发生等。最近的相关研究发现,生物体内还存在与miRNA长度不同的另一类非编码小RNA——piRNA（Piwi-interacting RNA）,它们的长度约为30nt,最初是在哺乳动物生殖细胞中发现。这种小RNA与Argonaute蛋白家族成员中的PIWI蛋白结合才能发挥它的调控作用,主要调控mRNA的稳定性、蛋白质的合成、染色质组织和基因组的结构。由于对piRNA的研究尚处于初级阶段,它的一些具体的功能和生源论尚在研究当中。目前,关于非编码小RNA的研究迅猛发展,miRNA数据库中已经收录了9539条成熟的miRNA分子,包括了从病毒、细菌、绿藻等低等生物到人、黑猩猩等高度生物。而piRNA数据库中只包括了人、小鼠、老鼠、果蝇、斑马鱼和鸭嘴兽,低等生物中还尚未发现piRNA。在环节动物中,只发现了一种动物（多毛纲的小头虫）的miRNA,没有发现piRNA。蚯蚓属于环节动物门的寡毛纲,雌雄同体,具有很强的再生能力,本课题选择赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）作为研究对象。由于赤子爱胜蚓的基因组尚未测序,因此对其miRNA和piRNA的鉴别研究工作存在很大难度,相关报道也是寥寥无几。但是,蚯蚓是重要的再生模式生物之一,对其miRNA及其再生相关miRNA的研究仍然具有十分重要的意义。因此本研究通过构建一个赤子爱胜蚓小RNA的cDNA文库,克隆到部分赤子爱胜蚓miRNA和piRNA,为以后研究其在再生过程中的调控作用打下一定的基础。首先选取赤子爱胜蚓性成熟的（有生殖环）个体大量提取总RNA;接着经10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,纯化回收16～30nt的小RNA;然后在小RNA两端分别加上3′接头和5′接头,每加完一个接头需要用PAGE分离纯化;再做反转录PCR,PCR产物经纯化回收目的片段后进行BanⅠ酶切,用T4 DNA连接酶进行自连,之后于两端加A;最后,与T载体连接,用TSS法制备和转化感受态细胞,建立cDNA文库。利用蓝白斑对文库进行初次筛选,再用菌落PCR进行再次筛选排除假阳性,将含有目的片段的43个菌落送出测序,得到20条单一的序列;在Genbank中的EST数据库和冗余数据库、miRNA数据库和piRNA数据库中进行BLAST比对,对于初步确定为候选miRNA的序列,用Mfold 3.2或RNA Structue软件进行二级结构的预测分析,以及A+U含量的分析。最后确定获得8条候选的蚯蚓miRNA、7条候选的piRNA和5条其它非编码小RNA。选用qRT-PCR方法进行不同组织的表达量分析,选择5.8S rRNA作为内参基因,选择了1条候选miRNA和3条候选piRNA作为目的基因,采用2-ΔΔCt法计算不同组织的表达量。结果说明再生组织中的表达量都大于正常组织,且每个小RNA的表达量都不一样,P2810表达最高,而P281-1表达最低。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 miRNA的简介
  • 1.1.1 miRNA的发现和特点
  • 1.1.2 miRNA生物合成过程及作用机制
  • 1.1.3 miRNA的生物学功能
  • 1.1.4 miRNA的研究方法
  • 1.2 再生生物、再生生物学与再生医学
  • 1.3 再生相关miRNA的研究现状
  • 1.4 研究目标和研究内容
  • 1.4.1 研究目标
  • 1.4.2 研究内容
  • 1.5 研究创新点
  • 第二章 蚯蚓非编码小RNA的克隆与序列分析
  • 2.1 材料与仪器
  • 2.1.1 菌株与实验材料
  • 2.1.2 分子生物学试剂
  • 2.1.3 细菌培养用试剂
  • 2.1.4 其他试剂及试剂盒
  • 2.1.5 RNA接头及引物
  • 2.1.6 主要仪器设备
  • 2.1.7 耗材的准备与处理
  • 2.2 实验方法与步骤
  • 2.2.1 总RNA的提取
  • 2.2.2 从总RNA中分离纯化小RNA
  • 2.2.3 小RNA加接头与PAGE纯化
  • 2.2.4 RT-PCR并电泳鉴定回收
  • 2.2.5 酶切、自连和两端加A
  • 2.2.6 连接、感受态细胞制备与转化
  • 2.2.7 菌落PCR与电泳检测
  • 2.2.8 序列测定
  • 2.2.9 生物信息学分析
  • 2.3 实验结果与分析
  • 2.3.1 提取的总RNA完整性分析与浓度测定
  • 2.3.2 含接头的小RNA RT-PCR电泳结果分析
  • 2.3.3 菌落PCR与电泳检测分析
  • 2.3.4 测序结果与序列分析
  • 2.4 讨论
  • 第三章 荧光定量RT-PCR鉴定表达量
  • 3.1 材料与仪器
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.2 试剂
  • 3.1.3 引物
  • 3.1.4 主要仪器设备
  • 3.2 实验方法与步骤
  • 3.2.1 总RNA的提取
  • 3.2.2 PAGE分离纯化小RNA
  • 3.2.3 小RNA加poly（A）尾
  • 3.2.4 反转录
  • 3.2.5 RNase H除去多余的小RNA
  • 3.2.6 荧光定量PCR
  • 3.2.7 数据处理
  • 3.3 实验结果与分析
  • 3.3.1 提取的总RNA完整性分析
  • 3.3.2 荧光定量PCR结果
  • 3.3.3 数据处理与结果分析
  • 3.4 讨论
  • 第四章 结论和展望
  • 4.1 结论
  • 4.2 展望
  • 参考文献
  • 附录 20条小RNA的测序图
  • 致谢
  • 硕士期间发表论文

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