论文摘要
本实验室采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,已经成功获得了共表达新城疫病毒（Newcastle Disease virus, NDV）F48E9株F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M,并证明其感染Sf9细胞后,可以在细胞表面形成并释放新城疫病毒样颗粒（Newcastle disease Virus-like particles,ND-VLPs）。为了研究ND-VLPs的免疫原性和免疫效力,本研究采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,并对其生物学特性进行分析。通过Western blot检测到培养上清中HN,F,NP,M蛋白的共表达,同时在负染电镜下观察到表面有纤突的类似NDV的圆形粒子,证明4种蛋白在Sf9细胞内装配成了VLPs,并以出芽的方式释放到上清。HA试验测定VLPs具有很高的凝集鸡红细胞的能力（10μg纯化的VLPs的HA效价为128）,说明HN组装入ND-VLPs以后,仍然保持血凝素的正确空间构象。试验结果表明ND-VLPs的分泌高峰是在感染后96h,单位体积（100ml感染上清）产量为1.57mg,4种蛋白的浓度范围分别为,HN:0.76-1.14μg/10μg VLPs,F:0.38-0.76μg/10μg VLPs,NP:1.14-1.52μg/10μg VLP,M:0.67-0.95μg/10μg VLPs。我们分别通过肌肉注射（辅以弗氏佐剂）和滴鼻途径（不加佐剂）,以不同剂量的ND-VLPs （10、20、25μg）免疫18日龄SPF鸡,并在首免后2周加强免疫一次,同时设PBS、NDV疫苗组及NDV疫苗+VLPs联合免疫作对照。首免后,监测血清中NDV特异性抗体滴度的动态变化。于二免后两周以3.16×103EID50的F48E9株强毒滴鼻攻毒。联合免疫组诱导产生的抗体水平显著高于其它组,提示VLPs具有良好的免疫原性,并可以提高常规疫苗的免疫效力。经肌肉注射途径免疫鸡可以诱导产生较高水平的HI、IgG及中和抗体。攻毒后,25μg VLPs实验组与NDV疫苗组、联合免疫组一样,能够100%抵抗致死剂量的NDV强毒攻击;经滴鼻途径,免疫鸡不仅可以产生较高水平的HI、中和抗体和局部粘膜抗体,还可以产生少量的循环抗体IgG。25μg ND-VLPs对致死剂量强毒的攻击也提供了90%的保护,说明ND-VLPs能够刺激机体产生粘膜免疫应答并具有一定的免疫保护力,但循环抗体IgG在抵抗强毒攻击过程中起着重要作用。ND-VLPs作为粘膜免疫抗原仍需要辅以合适的粘膜佐剂来增强其免疫效果。综上,ND-VLPs在昆虫细胞-杆状病毒表达系统上实现了高效组装,具有良好的免疫原性,并能有效的提高常规疫苗针对流行毒株的免疫效力,是一个很有前景的ND候选疫苗。