论文摘要
目的:米非司酮（mifepristone,又名RU486）,是一种合成类固醇,其结构类似炔诺酮,具有抗孕酮、抗糖皮质激素和轻度抗雄激素特性。其结合位点是孕激素受体。较早的研究认为米非司酮抗早孕的机制是高浓度孕激素使蜕膜发生变性、坏死,导致绒毛滋养层细胞变性、胚胎死亡而终止妊娠。随着研究的深入,发现米非司酮可直接作用于绒毛滋养层细胞,使米非司酮的抗早孕机制更加复杂。米索前列醇与胚胎死亡无直接关系,但可使子宫平滑肌的收缩以排出坏死胚胎组织。米非司酮作为孕激素受体拮抗剂,不仅影响孕酮的生物学效应,对妊娠及其产物的代谢和形态结构的影响也是多方面的。其作用机制仍在探索之中。骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）是细胞外基（Extracellular- matrix,ECM）中的一种重要的分泌型细胞因子,它含有精-甘-d冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）序列,其主要的受体为整合素avβ3,二者相互作用共同参与细胞的聚集、黏附、增殖和迁移及免疫调节一系列重要过程。骨桥蛋白受孕激素调控,机体内多种组织细胞均能合成并分泌该因子。研究表明,猪妊娠30d后沿着整个子宫-胎盘交接面都有OPN蛋白表达。此外,妊娠期子宫内膜致密层内的免疫细胞也有OPN的mRNA和蛋白表达。因此,推断OPN表达于子宫内膜上皮和免疫细胞,与其受体（如整合素）一起作用于孕囊和子宫以促进孕囊发育,在胚泡粘附和胎盘形成中起关键作用。另外OPN与整合素avβ3同时表达于滋养层细胞上,胎盘绒毛滋养层细胞可分泌OPN,通过促进细胞间黏附,诱导细胞趋化使滋养层迁徙,从而调节受精卵的定位、黏附、植入。OPN表达的不足或过量可能会导致疾病,如不明原因的不孕、流产、早产或子宫内膜异位症、滋养层细胞疾病等。绒毛膜促性腺激素-β（Choriogonadotrophin-β,β-HCG）是由胎盘合体滋养层细胞产生并分泌,是在母体血液中最早可测到的一种糖蛋白激素,由α,β两个链组成,其中β-HCG的抗原特异性强,能更精确地反映HCG在人体血、尿中的浓度,测定血β-HCG值在一定程度上反应了胚胎发育的活力。β-HCG作为妊娠的特异性标志物,其功能是维持早期妊娠黄体的继续生长,刺激黄体产生雌、孕激素,以维持妊娠,直至完全被胎盘取代。血β-HCG的产生与滋养层细胞的数量和发育有关。Bischof等报道米非司酮能显著抑制体外培养的胚胎滋养层产β-HCG和妊娠相关α血浆蛋白（PAPP-A）,该抑制效应能被孕激素（对PAPP-A和β-HCG）和皮质醇（对β-HCG）消除。P53蛋白最早是在1979年首次被发现,其分子量53kD,故取名P53。P53是一种同源致癌基因,参与细胞周期的调节和凋亡的发生。P53的表达在调节胚胎滋养层的动态平衡中起着不可缺少的作用。米非司酮诱导P53蛋白的上调可能在母胎界面的凋亡中起着重要作用。P53的另一重要作用是诱导凋亡。P53直接参与细胞凋亡过程,主要通过降低Bcl-2和升高Bax的表达来实现。近年来有研究发现,在用米非司酮终止妊娠过程中,母胎界面相关细胞中Bcl-2表达降低,同时Bax升高。迄今为止,米非司酮对早孕绒毛及蜕膜组织的OPN表达的研究国内外未见报道。本实验采用免疫组织化学SP法,透射电镜技术来研究米非司酮对早孕绒毛及蜕膜组织中OPN、β-HCG和P53蛋白表达的影响,进一步探讨米非司酮抗早孕的机制,并为OPN在胚泡着床和胎盘形成过程中的重要作用提供理论依据。方法1取材:（1）实验组（米非司酮组）:自愿要求终止妊娠的早孕妇女20例,均为首次服用米非司酮50mg,继后25mg,每日2次,总量150 mg,于第三d晨8:00加服米索前列醇600μg,留院观察,孕囊排出后即刻收集绒毛组织及蜕膜。（2）对照组（手术流产组）:自愿要求终止妊娠的早孕妇女20例,均为行负压吸引人工流产术,术毕即刻收集绒毛组织及蜕膜。2光镜技术:应用HE染色、免疫组织化学染色SP法,结果结合图像分析检测OPN、β-HCG和P53蛋白表达情况。3电镜技术:取米非司酮组和手术流产组绒毛组织,透射电镜下观察非司酮组和手术流产组的绒毛组织形态结构。结果1 HE染色结果手术流产组可见正常早孕绒毛及蜕膜组织形态学,细胞滋养层细胞呈立方形,单层,胞膜完整。合体滋养层细胞较厚,细胞质融合,细胞无界限。蜕膜细胞胞体肥大,含有大量的糖原和脂滴。米非司酮组为部分绒毛间质水肿,表面附少量纤维蛋白样物,血管扩张,绒毛间质内有炎性细胞浸润,滋养层细胞结构清楚。蜕膜组织呈小灶性变性、坏死,炎症细胞浸润;少数细胞核固缩、破碎,细胞质不均匀及空泡变性。2免疫组织化学结果2.1 OPN的阳性表达产物为棕黄色颗粒,主要位于细胞膜和（或）细胞质内,手术流产组早孕绒毛组织中合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞都有OPN的表达,以合体滋养层细胞表达较强。蜕膜组织的腔上皮、腺上皮基膜、蜕膜细胞均有OPN的表达。米非司酮组绒毛组织及蜕膜组织中相应部位OPN的表达强度明显减弱。2.2β-HCG的阳性表达产物为棕黄色颗粒,主要位于细胞膜和（或）细胞质内,手术流产组早孕绒毛组织中合体滋养层细胞细胞质内β-HCG强表达,蜕膜组织的基质、腺上皮、蜕膜细胞细胞质内均有β-HCG表达,米非司酮组早孕绒毛组织中、蜕膜中相应部位β-HCG免疫反应强度均明显减弱。免疫反应强度下降最为明显的是绒毛组织的合体滋养层细胞和蜕膜组织的基质细胞、腺上皮细胞。2.3 P53的表达产物为棕黄色颗粒,主要位于细胞核。手术流产组早孕绒毛组织中存在少数的P53阳性细胞,P53阳性细胞主要出现在细胞滋养层细胞。蜕膜组织中也存在少数的P53阳性细胞。米非司酮组早孕绒毛组织中滋养层细胞P53阳性细胞显著增加,蜕膜组织中P53阳性细胞也显著增加。3电镜结果透射电镜下米非司酮药物流产后,显示微绒毛减少甚至缺失,部分微绒毛变性、扩张呈泡状;细胞质内脂滴增多、内质网扩张;合体滋养层细胞与细胞滋养层细胞核固缩等退行性改变。结论1 OPN表达于细胞质和/或细胞膜上, OPN在早孕绒毛及蜕膜的阳性表达米非司酮组显著低于手术流产组,具有显著性差异。米非司酮药物流产后,OPN表达降低,这一结果提示米非司酮可能抑制了早孕绒毛及蜕膜中OPN的合成,使滋养层细胞和蜕膜细胞的黏附、增殖和迁移能力下降,影响了胚泡着床和胎盘的形成,导致流产。2β-HCG表达于细胞质和/或细胞膜上。β-HCG在早孕绒毛及蜕膜的阳性表达米非司酮组显著低于手术流产组,具有显著性差异。这一结果提示米非司酮可能抑制了早孕绒毛及蜕膜中β-HCG的合成,使黄体功能减退,难以维持妊娠,最终流产。3 P53表达于细胞核。P53在早孕绒毛及蜕膜的阳性表达米非司酮组显著高于手术流产组,具有显著性差异。这一结果提示米非司酮可能促进了早孕绒毛及蜕膜中的P53的表达,使滋养层细胞和蜕膜细胞凋亡增加,最终胚胎停止发育,妊娠终止。