几种农杆菌的耐酚性能比较与驯化研究

论文摘要

茶树（Camellia sinensis（L.）Kuntze）是我国重要的一种经济作物。随着我国现代社会需求的迅猛发展,茶树优良品种的培育与推广也在进一步加快,传统的育种方法因为周期长已经不能满足社会对茶产品的需要;当前分子生物学,尤其转基因技术已趋成熟,因此被广泛运用到包括茶树在内的植物育种工作中。农杆菌介导法是很多植物进行遗传转化研究的常规途径。茶树的转基因技术研究大多数采用的也是农杆菌法。但至今为止,茶树的基因转化研究仍停留在技术层面,许多报道仅得到一些发根或GUS瞬时表达结果,且诱导频率也不高,只有4%-25%。茶树（Camellia sinensis）是一种富含儿茶素等多酚类物质的多年生木本植物。茶树中富含的儿茶素等酚类物质是制约农杆菌介导法对茶树进行遗传转化的关键因子。有关多酚类物质对茶树遗传转化影响的作用规律等都还不清楚。为此,本文选择了发根农杆菌和根癌农杆菌各两种,进行了不同农杆菌菌株耐酚性能差异的比较研究,和耐酚菌株的驯化培养试验,并采用驯化后的菌株进行了茶树叶片和愈伤两种外植体的转化试验,以期望能更全面地了解茶多酚类物质对茶树农杆菌遗传转化的影响方式与规律,从而能够设法提高茶树农杆菌法转基因育种研究的成功率。本文的主要研究结果如下:为了明确不同农杆菌种对茶多酚的耐受性能变化幅度,以及驯化培养对提高农杆菌茶多酚耐受性、从而提高茶树遗传转化中遗传转化率的作用与可行性,本研究比较了茶多酚对四种农杆菌生长的抑制率,进行了耐酚菌株的驯化培养。结果表明:茶多酚对几种农杆菌均有明显的生长抑制作用,但不同菌种的耐受性能差异较大。通过检测GUS瞬间表达,对影响根癌农杆菌侵染茶树叶片和愈伤效果的若干因素进行研究。Kan对茶树叶片愈伤组织形成的抑制浓度在30mg/L左右,因而对以Kan为筛选标记的载体来说,50mg/L Kan是较为适宜的选择浓度。茶树较为适宜的农杆菌转化系统是用OD600为0.5-0.8的EHA105侵染10分钟左右,暗中28℃共培养3天。通过驯化培养得到的耐酚菌株EHA105AP,其耐酚性能与原始菌株EHA105相比明显提高,其耐酚性能提高了90.89%,同时,其在茶树叶片和愈伤遗传转化中的GUS瞬时表达率也分别提高了43.85%和57.55%,并达显著性差异（P＜0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一章 前言
• 1.1 植物转基因技术进展
• 1.1.1 直接基因转化系统
• 1.1.1.1 基因枪介导基因转化法
• 1.1.1.2 脂质体介导基因转化法
• 1.1.1.3 PEG介导基因转化法
• 1.1.1.4 显微注射介导基因转化法
• 1.1.1.5 电激介导基因转化法
• 1.1.1.6 离子束介导基因转化法
• 1.1.1.7 激光微束介导基因转化法
• 1.1.2 种质转化系统
• 1.1.2.1 花粉管通道介导基因转化法
• 1.1.2.2 生殖细胞浸泡介导基因转化法
• 1.1.3 农杆菌转化系统
• 1.1.3.1 根癌农杆菌
• 1.1.3.2 发根农杆菌
• 1.2 茶树遗传转化研究进展
• 1.2.1 茶树农杆菌介导基因转化法
• 1.2.2 茶树基因枪遗传转化研究
• 1.3 茶树遗传转化中存在的问题与对策
• 1.3.1 缺乏高频的植株再生体系
• 1.3.2 缺乏有效的转化方法和筛选体系
• 1.4 影响农杆菌对植物遗传转化效率的因素
• 1.4.1 不同农杆菌菌株属性对转化的影响
• 1.4.2 植物基因型及外植体对转化的影响
• 1.4.3 多酚类物质对转化的影响
• 1.4.4 化学因子对转化的影响
• 1.4.5 物理因子对转化的影响
• 1.5 国内外茶叶相关研究进展
• 1.5.1 儿茶素的研究进展
• 1.5.2 农杆菌对茶树遗传转化研究
• 1.6 本研究的目的意义与主要研究内容
• 1.6.1 目的意义
• 1.6.2 主要研究内容
• 1.6.2.1 农杆菌菌株特性及对茶多酚的耐受性研究
• 1.6.2.2 耐酚菌株的筛选及其驯化研究
• 1.6.2.3 农杆菌介导茶树的转化条件的优化
• 1.6.2.4 驯化菌株转化能力的鉴定
• 1.7 创新之处
• 第二章 农杆菌菌株特性及对茶多酚的耐受性研究
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌液生长曲线的制作方法
• 2.2.1.1 冷冻干燥菌种的恢复培养
• 2.2.1.2 四种菌株生长曲线的制作
• 2.2.2 茶多酚成分的测定
• 2.2.2.1 流动相配制
• 2.2.2.2 茶多酚柱前衍生反应
• 2.2.2.3 色谱条件
• 2.2.3 农杆菌对茶多酚的耐受性比较
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 四种菌株生长活力的测定结果
• 2.3.2 茶多酚成分的测定
• 2.3.3 不同农杆菌对茶多酚的耐受性比较
• 第三章 农杆菌耐酚菌株的筛选与驯化研究
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 菌株和载体
• 3.1.2 AB培养基
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 农杆菌的茶多酚耐受性驯化实验
• 3.2.2 抗酚菌株与原始菌株的生长活力比较
• 3.2.3 抗酚菌株与原始菌株的耐酚性比较
• 3.2.4 数据分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 针对茶多酚耐受性的农杆菌驯化培养
• 3.3.2 抗酚菌株与原始菌株的生长活力比较
• 3.3.3 抗酚菌株与原始菌株的耐酚性比较
• 第四章 转化条件的优化
• 4.1 材料和试剂
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 酶及主要试剂
• 4.1.3 仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 卡那霉素的抗性筛选
• 4.2.2 共培养时间对GUS瞬时表达的影响
• 4.2.3 农杆菌菌液浓度对GUS瞬时表达的影响
• 4.2.4 侵染时间对GUS瞬时表达的影响
• 4.2.5 数据分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 卡那霉素的抗性筛选
• 4.3.2 共培养时间对外植体GUS瞬时表达的影响
• 4.3.3 农杆菌菌液浓度对GUS瞬时表达的影响
• 4.3.4 侵染时间对GUS瞬时表达的影响
• 第五章 驯化菌株转化能力的验证
• 5.1 材料和试剂
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 细菌菌株及转化质粒
• 5.1.3 酶及主要试剂
• 5.1.4 仪器设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 质粒载体pCAMBIA1301的图谱
• 5.2.2 冻融法转化农杆菌
• 5.2.2.1 感受态细胞的制备
• 5.2.2.2 转化
• 5.2.2.3 碱法小批量抽提质粒DNA
• 5.2.2.4 表达载体的单酶切验证
• 5.2.2.5 核酸电泳
• 5.2.3 抗酚菌株与原始菌株转化率的比较
• 5.2.4 CTAB法提取植株基因组DNA
• 5.2.5 转化植株的PCR检测
• 5.2.5.1 引物的设计与合成
• 5.2.5.2 琼脂糖凝胶检测
• 5.2.6 数据分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 冻融法转化农杆菌
• 5.3.2 抗酚菌株与原始菌株转化率的比较
• 5.3.3 PCR产物验证
• 第六章 总结
• 6.1 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文