文蛤活性多肽生物学效应的研究

论文摘要

目前各国学者采用现代科学方法与技术从海洋生物中分离和鉴定出了多种具有抗肿瘤药理作用的天然物质,为研制开发抗肿瘤新药奠定了基础,显示出诱人的研究开发前景,从海洋生物及其代谢产物中筛选和提取具有特异化学结构的天然活性物质成为抗肿瘤药物开发的重要来源。文蛤（Meretrix meretrix Linnaeus）作为一种深受人们喜爱的海洋软体动物,不仅具有丰富的营养价值,更是有着极高的药用价值。古往今来,文蛤的药用价值一直深受人们的重视,它具有清热利湿、化痰、散结的功效,对肝癌、肺癌、胃癌、甲状腺肿瘤等有明显的抑制作用,而且还能够发挥降糖,降血脂,抗突变、抗衰老等多种生理功能。其有效成分及生理作用受到越来越广泛的关注。本研究采用破碎、硫酸铵沉淀、乙醇抽提、Sephadex G-25分子筛层析等方法从文蛤中提取得到五个峰的物质,利用MTT法分别检测各峰体外对癌细胞的抑制效应,发现第二峰的物质能抑制癌细胞的生长,将此活性物质命名为mer2。将mer2处理子宫颈癌Hela、肺癌A549和胆管癌QBC939细胞,观察研究mer2对癌细胞的生物学效应并进一步探索其抑制癌细胞生长的作用机理。结果表明,mer2对三种细胞均有不同程度的抑制作用,当浓度大于40μg/mL时,对Hela细胞、肺癌A549细胞的抑制率便超过了50%,其中对肺癌A549细胞的抑制作用最强。通过光学显微镜、Hoechst染色和流式细胞技术等方法,研究了文蛤多肽对体外培养的肺癌A549细胞的细胞形态、细胞周期的影响。结果表明:文蛤多肽处理后的细胞外形变化明显,细胞体积变小,细胞群体数量显著稀疏,贴壁细胞数量减少,出现皱缩、变圆、脱落。Hoechst染色结果表明经文蛤多肽处理的细胞其细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,颜色有些发白,出现凋亡表现。细胞周期的检测结果也说明,经该多肽处理的肺癌A549细胞周期发生明显变化,出现明显的凋亡峰,但细胞周期未出现明显阻滞现象。表明文蛤多肽对癌细胞的生长抑制作用与细胞凋亡有关。我们采用动力学研究方法,体外研究了文蛤活性多肽对碱性磷酸酶（ALPase）、锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）、蘑菇酪氨酸酶（Tyrosinase）活力的影响。结果表明该活性多肽对这三种酶均有一定抑制作用,抑制过程呈浓度的关系,其中对NAGase的抑制作用是一种可逆过程,为混合型抑制,使酶活力丧失50%的抑制剂浓度(IC50)为112.9μg/mL。对Tyrosinase的抑制作用为非竞争型,其IC50为85μg/mL。同时,采用DPPH法研究了该活性多肽的抗氧化能力,结果显示其具有一定的清除氧自由基的能力。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 海洋生物抗肿瘤活性物质研究简介
• 1.1.1 海洋生物抗癌活性物质的物种来源
• 1.1.1.1 来源于海洋动物的抗肿瘤活性物质
• 1.1.1.2 来源于海洋植物的抗肿瘤活性物质
• 1.1.1.3 来源于海洋微生物的抗肿瘤活性物质
• 1.1.2 海洋生物抗癌活性物质的化学成分
• 1.1.2.1 肽类
• 1.1.2.2 多糖类
• 1.1.2.3 大环内酯类
• 1.1.2.4 生物碱类
• 1.1.2.5 萜类
• 1.1.2.6 苷类
• 1.1.2.7 多烯醚类
• 1.1.2.8 多聚乙酰类
• 1.1.2.9 酮类
• 1.1.2.10 其它
• 1.1.3 海洋生物抗肿瘤活性物质的作用机理
• 1.1.3.1 诱导肿瘤细胞凋亡
• 1.1.3.2 引起肿瘤细胞的周期阻滞
• 1.1.3.3 影响肿瘤细胞的微丝功能
• 1.1.3.4 干扰肿瘤细胞微管活性
• 1.1.3.5 提高机体免疫功能
• 1.2 文蛤研究概况
• 1.2.1 抗癌作用
• 1.2.2 增强免疫作用
• 1.2.3 降糖、降血脂作用
• 1.2.4 其它功能
• 1.3 几种酶的酶学特征及应用
• 1.3.1 碱性磷酸酶
• 1.3.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶
• 1.3.3 酪氨酸酶
• 1.4 本课题的研究内容与研究意义
• 2 实验材料、仪器与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 文蛤活性多肽的分离纯化
• 2.3.2 蛋白浓度测定
• 2.3.3 肿瘤细胞培养及细胞生物学效应的测定
• 2.3.3.1 细胞复苏
• 2.3.3.2 传代
• 2.3.3.3 文蛤活性多肽对几种体外培养癌细胞的浓度效应
• 2.3.3.4 文蛤活性多肽对肺癌A549细胞形态结构的影响
• 2.3.3.5 Hoechst染色
• 2.3.3.6 细胞生长曲线的测定
• 2.3.3.7 文蛤活性多肽对肺癌A549细胞周期的影响
• 2.3.4 文蛤活性多肽对酶的影响
• 2.3.4.1 文蛤活性多肽对碱性磷酸酶活力的影响
• 2.3.4.2 文蛤活性多肽对N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响
• 2.3.4.3 文蛤多肽对酪氨酸酶活力的影响
• 2.3.5 DPPH法检测文蛤活性多肽抗氧化活性
• 3 实验结果
• 3.1 文蛤活性多肽的分离纯化
• 3.2 文蛤抗癌活性多肽对癌细胞的细胞生物学效应
• 3.2.1 MTT法测定文蛤活性多肽对几种癌细胞抑制作用
• 3.2.2 文蛤活性多肽对肺癌A549细胞形态的影响
• 3.2.2.1 光学显微镜细胞形态的观察
• 3.2.2.2 Hoechst染色细胞形态的观察
• 3.2.3 文蛤活性多肽对肺癌A549细胞生长曲线的影响
• 3.2.4 文蛤活性多肽对肺癌A549细胞周期的影响
• 3.3 文蛤抗癌活性多肽的酶学效应
• 3.3.1 文蛤活性多肽对ALP活力的影响
• 3.3.2 文蛤活性多肽对锯缘青蟹NAGase活力的影响
• 3.3.2.1 文蛤活性多肽对锯缘青蟹NAGase的效应
• 3.3.2.2 文蛤活性多肽对锯缘青蟹NAGase的抑制机理
• 3.3.2.3 文蛤活性多肽对锯缘青蟹NAGase的抑制类型
• 3.3.3 文蛤活性多肽对蘑菇Tyrosinase活力的影响
• 3.3.3.1 文蛤活性多肽对蘑菇Tyrosinase的效应
• 3.3.3.2 文蛤活性多肽对蘑菇Tyrosinase抑制机理
• 3.3.3.3 文蛤活性多肽对蘑菇Tyrosinase的抑制类型
• 3.4 文蛤活性多肽的抗氧化活性
• 4 讨论
• 4.1 文蛤活性多肽的纯化及其细胞生物学效应
• 4.2 文蛤活性多肽的酶学效应分析
• 4.2.1 文蛤活性多肽对ALPase的作用
• 4.2.2 文蛤活性多肽对锯缘青蟹NAGase的作用
• 4.2.3 文蛤活性多肽对蘑菇Tyrosinase的作用
• 4.3 文蛤活性多肽抗氧化活性分析
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 已发表论文
• 8 致谢