基质金属蛋白酶及其抑制剂在风湿性二尖瓣组织中的表达及意义

论文摘要

风湿性心脏病（Rheumatic Heart Disease,RHD）简称风心病,足风湿性炎症所致的包括心内膜、心肌、心外膜、心包及传导系统在内的全心脏炎,但永久性损害往往局限于心脏瓣膜,其中单纯二尖瓣病变最为常见,占95%～98%。基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）是一类锌依赖的蛋白水解内肽酶,能特异性地降解细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）,主要参与ECM的重构过程。金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases,TIMPs）是机体存在的MMPs的内源性特异性抑制剂,与调节MMPs的活动密切相关。MMPs的表达和调控失衡可以引起多种疾病,如心血管疾病、肺部疾病、关节炎、肿瘤等。因此,MMPs与疾痫的关系已经成为众多国内外学者研究的热点。本研究分两部分,旨在观察MMPs/TIMPs在风湿性病变的二尖瓣组织中的表达状态,了解其表达高低与病理类型、临床心功能分级、心房颤动的关系,进而探讨风湿性二尖瓣组织基质重构的机制。第一部分基质金属蛋白酶及其抑制剂在风湿性二尖瓣组织中的表达目的1.观察RHD二尖瓣组织学及超微结构变化;2.探讨MMPs及TIMPs在风湿性二尖瓣组织中的表达水平及意义。方法1.实验分组:将16例于2007年6月～11月期间在广州军区武汉总医院心胸外科接受二尖瓣置换手术的成人RHD患者的二尖瓣前、后瓣叶组织作为实验组,另取7例无心脏病变的成人意外死亡者二尖瓣前、后瓣叶组织作为对照组。2.病理学检查:所有标本行HE染色,观察实验组和对照组的组织学变化。选取典型RHD患者的二尖瓣前、后瓣叶制作电镜标本,在透射电子显微镜（TEM）下观察二尖瓣组织胶原纤维及线粒体等变化。3.采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定实验组和对照组MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达水平,PCR扩增产物电泳图像扫描后测定目的基因和β-actin基因的电泳条带灰度积分,以二者比值表示待测基因mRNA相对含量。4.采用免疫组织化学染色（SABC法）对实验组和对照组二尖瓣前、后瓣叶组织中MMP-2、MMP-13、TIMP-1及TIMP-2进行染色,光镜观察后应用HPAIS1000高清晰度彩色病理图像分析系统采集图像,Image-Pro Plus version 6.0软件对MMP-2、MMP-13的表达水平进行积分光密度（IOD）测定,取其平均值作为量化指标,比较两组MMP-2、MMP-13的蛋白表达水平。结果1.与对照组相比,实验组HE染色显示瓣膜结构不清,纤维组织增生,粘液样变性,胶原纤维玻璃样变性、钙化等改变。电子显微镜观察显示典型RHD二尖瓣组织胶原纤维增生,排列紊乱、断裂;线粒体肿胀、聚集,部分出现空泡样变。2.RT-PCR结果显示实验组MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达水平较对照组均显著增加,且差异有统计学意义（t=3.109,P=0.005;t=2.862,P=0.009;t=2.357,P=0.028;t=2.844,P=0.010）。3.与对照组相比,实验组免疫组织化学结果显示层次不清,可见较多新生血管形成:MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2在瓣膜的间质细胞、内皮细胞、炎性细胞等胞浆中表达增多;实验组MMP-2、MMP-13的IOD值高于对照组,且差异有统计学意义（Z=-2.633,P=0.008;Z=-2.936,P=0.003）。结论1.风心病二尖瓣前、后瓣叶组织结构及超微结构均显示其细胞外基质有明显病理改变,即纤维组织增生,粘液样变性,胶原纤维排列紊乱、断裂和玻璃样变性、钙化。2.风湿性二尖瓣组织中MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达水平及蛋白表达水平显著增加,提示MMPs/TIMPs表达上调可能是RHD二尖瓣细胞外基质重构的重要分子机制,为进一步研究和防止RHD瓣膜基质重构提供了理论依据。第二部分基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达与二尖瓣风湿性改变的病理类型、临床心功能分级及心房颤动的关系目的1.比较在不同二尖瓣病理类型、临床心功能分级及有无心房颤动时超声心动图主要检测指标的变化;2.研究风湿性二尖瓣不同病理类型、临床心功能分级及有无心房颤动对二尖瓣组织中MMPs、TIMPs基因表达水平的影响。方法1.研究对象:选取于2007年6月～11月期间在广州军区武汉总医院心胸外科接受二尖瓣置换手术的16例RHD患者为研究对象,其中男3例,女13例,平均年龄42.06岁。根掘病理类型分为二尖瓣狭窄为主的MS组（二尖瓣口面积＜1.2cm2,反流≦2+）和二尖瓣关闭不全为主的MR组（二尖瓣口面积＞1.2cm2,反流3+～4+）,根据临床心功能分级（NYHA标准）分为心功能Ⅲ-Ⅳ级组（A组）和心功能Ⅱ级组（B组）,根据有无心房颤动分为心房颤动组（Ⅰ组）和实性心律组（Ⅱ组）。2.检测内容:收集临床资料,采用美国Agilent SONOS 5500多普勒超声诊断仪,于手术前2-5天对患者进行常规心脏超声检查。病人左侧卧位,取标准胸骨旁长轴切面,测量左房内径（LAd）、左室舒张末期内径（LVDd）,计算左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（LVFS）。采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定RHD患者二尖瓣组织中MMP-2、MMP-13、TIMP-1及TIMP-2的mRNA表达水平,PCR扩增产物电泳图像扫描后测定目的基因和β-actin基因的电泳条带灰度积分,以二者比值表示待测基因mRNA相对含量。结果1.超声心动图检测结果分析,MS组与MR组比较,前者左室舒张末期内径小于后者,且差异有统计学意义（t=-3.429,P=0.004）。A组与B组比较,超声心动图各检测指标的差异均无统计学意义。Ⅰ组与Ⅱ组比较,前者左房内径较后者显著增大,且差异有统计学意义（t=2.209,P=0.044）。2.MS组与MR组、A组与B组比较,MMP-2、MMP-13及TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达水平的差异均无统计学意义;而Ⅰ组与Ⅱ组比较,MMP-2、MMP-13的mRNA表达水平高于后者,且差异有统计学意义（t=2.681,P=0.018:t=2.392,P=0.031）。结论1.风心病以二尖瓣关闭不全为主的患者其左室舒张末期内径较以二尖瓣狭窄为主的患者明显增大,表明病理类型与左心室构型改变有关;心房颤动患者左房内径较窦性心律者明显增大,表明心房颤动与左心房构型改变有关。2.风湿性二尖瓣不同病理类型和临床心功能分级对该瓣膜组织中MMPs、TIMPs的表达水平无明显影响。心房颤动的出现与存在伴随MMP-2、MMP-13表达水平的显著上调。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 背景与前言
• 参考文献
• 第2章 基质金属蛋白酶及其抑制剂在风湿性二尖瓣组织中的表达
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 参考文献
• 附图
• 第3章 基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达与二尖瓣风湿性改变的病理类型、临床心功能分级及心房颤动的关系
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 参考文献
• 综述:基质金属蛋白酶与风湿性心脏病的研究进展
• 攻读学位期间成果
• 中英文缩略表
• 致谢