LP（a）对小鼠骨髓源性内皮祖细胞损伤作用的初步研究

论文摘要

目的：初步探讨心血管疾病独立危险因子脂蛋白（a）[LP（a）]对小鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）的损伤作用及其可能的机制。方法：实验分为6组：①对照组，加等量含200μmol/L EDTA的全培养液；②1μg/ml的LP（a）处理组，③10μg/ml LP（a）处理组，④100μg/ml的LP（a）处理组，⑤300μg/ml LP（a）处理组，⑥600μg/ml LP（a）处理组。贴壁法分离与培养内皮祖细胞（EPCs），摄取ac-LDL和结合UEA-1鉴定EPCs，MTT法检测细胞存活与增殖，transwell测定细胞迁移，明胶粘附法测定EPCs的粘附，基质胶上种植EPCs，photshop7.0计算血管长度，显微镜下观测单个细胞克隆大小和克隆数目，RT-PCR和western blotting分别检测一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA水平和蛋白表达情况，细胞免疫组织化学技术检测eNOS蛋白在EPCs的表达和分布情况，并采用DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧（ROS）的量，采用Griess试剂法测定一氧化氮（NO）水平。结果：①采用贴壁法能从小鼠鼠骨髓的单个核细胞中分离出纯度达70%以上的EPCs。②LP（a）剂量依赖性影响EPCs存活，100μg/ml LP（a）开始对EPCs产生一定的破坏作用，300μg/ml LP（a）对EPCs的破坏作用急速加大。③1μg/mlLP（a）即能显著抑制EPCs的迁移，当LP（a）浓度达到10μg/ml时，迁移到下槽的细胞数目大大减少，其迁移细胞数不到对照组的1/6，LP（a）浓度为100μg/ml时，其迁移细胞数减少到对照组的1/9，300μg/ml时其迁移细胞数约为对照组的1/14。④LP（a）剂量依赖性抑制EPCs的粘附。1μg/ml的LP（a）可明显减少EPCs粘附细胞数目（145.2±8.4个/每个视野vs115.2±12.6个/每个视野，P＜0.05，n=5），当LP（a）的浓度达到10μg/ml时，EPCs粘附能力进一步下降，下降到对照组的1/2，当LP（a）的浓度达到100μg/ml时下降到对照组的约1/3，当LP（a）的浓度达到300μg/ml时，EPCs粘附能力下降最显著，其下降到对照组的约1/16。⑤EPCs经10μg/ml LP（a）处理后，血管形成能力的明显受到损伤，当LP（a）的浓度增加到100μg/ml时，EPCs的血管形成能力大大减弱，已经不到对照组的1/4（36.34±1.54mm/每个视野vs8.76±0.62mm/每个视野，P＜0.001，n=5）；当LP（a）的浓度增加到300μg/ml时，差不多已经见不到完整的血管样结构。⑥经100μg/ml的LP（a）处理后，不但克隆数目明显减少（10.2±1.3vs3.1±0.4，P＜0.01，n=5），而且克隆生长明显受到抑制。⑦机制研究发现： EPCs经过100μg/ml的LP（a）处理后， eNOS mRNA和蛋白表达均显著下调，一氧化氮（NO）显著减少（36.35±3.91vs3.91±0.79，P＜0.001，n=3）。活性氧检测结果表明，在1μg/ml LP（a）作用下，活性氧产生显著增加（1±0.12vs3.92±0.36，P＜0.05，n=5）；当LP（a）的浓度为10μg/ml时，荧光强度是对照组的近15倍；当LP（a）的浓度为100μg/ml时，与前述各组相比较，胞内绿色荧光强度和发出绿色荧光的细胞均增多（图12D），其荧光强度是对照组的31倍多，是1μg/mlLP（a）的近8倍，是10μg/ml LP（a）的2倍多。结论：①LP（a）浓度依赖性地抑制EPCs增殖；②LP（a）浓度依赖性地抑制EPCs迁移；③LP（a）浓度依赖性地抑制EPCs粘附；④LP（a）浓度依赖性地抑制EPCs血管形成能力；⑤LP（a）抑制EPCs的克隆形成；⑥LP（a）对EPCs的损伤作用与抑制eNOS表达和NO生成有关，还与促进活性氧生成有关。

论文目录

• 主要缩略语英文索引
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 硕士期间发表论文
• 致谢