玫瑰黄链霉菌几丁质酶基因及抗生素合成基因簇研究

论文摘要

链霉菌是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阳性菌,是重要的天然抗生素和几丁质酶产生菌。几丁质酶可通过催化几丁质的水解,破坏植物病原真菌细胞壁的主要组分,从而起到抑制植物病害发展的作用。本研究应用平板稀释法从棉花根围土壤样品中分离到了360株链霉菌,采用双层平板法测定它们对棉花黄萎病菌生长的抑制作用。此外还对本实验室保存的24株生防链霉菌进行了抑菌活性测定,这24株生防链霉菌对棉花黄萎菌都表现出很好的抑菌效果。 对表现抑菌活性的185株拮抗链霉菌菌株使用透明圈法测定,发现其中115株有几丁质酶活性。采用水煮法、STE法、SDS法、微波法等4种方法提取链霉菌的DNA,并以链霉菌16SrDNA引物来扩增提取到的DNA。结果表明除STE法外,其他3种方法所提样品都能扩增出预想的约1.6Kb的片段,且利用水煮法可以更快速、有效的提取出适用于PCR分子探测的链霉菌DNA。 从GenBank中检索到26个链霉菌几丁质酶基因序列,根据保守序列,设计了两对PCR引物（Chi-1/Chi-2和Chi-3/Chi-4）。对115株有几丁质酶活性的菌株进行PCR扩增,有112株可以扩增出预期的特异片段。其中48株菌株对两对引物都有扩增产物,92株对Chi-1/Chi-2引物有产物,68株对Chi-3/Chi-4引物有产物。分别选择两菌株的两对引物组合的扩增产物测序,BLAST比较发现这些产物与其对应的几丁质酶基因类型一致,从而证明了两对引物的可靠性,建立了一套可以快速鉴定几丁质酶产生菌的PCR探测方法。 Men-myco-93-63菌株是从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离得到链霉菌菌株,经鉴定为玫瑰黄链霉菌。该菌及其次生代谢产物对不同致病力的棉花黄萎病菌及其它多种植物病原菌均表现较强的抑制作用。在本实验室前期研究的基础上进行了该菌株生防相关基因克隆的研究: 1.克隆了Men-men-93-63几丁质酶基因C的催化域区域;PCR扩增得到包含信号肽区、纤维素结合区、几丁质结合区三个结构功能域的变铅青链霉菌几丁质酶C（S.lividans ChiC）基因片段,此片段与催化域部分、质粒pET23b（+）连接,构建成表达载体pLCH转化大肠杆菌,转化子诱导表达后在几丁质酶培养基上表现几丁质酶蛋白活性。

论文目录

• 第一章：拮抗链霉菌几丁质酶基因分子探测
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 链霉菌菌株的分离
• 2.2.2 拮抗链霉菌菌株的筛选
• 2.2.3 链霉菌菌株的保藏
• 2.2.4 产几丁质酶菌株的筛选
• 2.2.5 链霉菌DNA提取方法
• 2.2.6 几丁质酶基因保守引物设计、合成和扩增
• 2.2.7 PCR扩增测序
• 2.2.8 PCR扩增片段的BLAST分析
• 3 结果与分析
• 3.1 拮抗链霉菌分离
• 3.2 拮抗链霉菌菌株的几丁质酶活性测定
• 3.3 快速提取链霉菌DNA的方法
• 3.4 几丁质酶基因保守引物设计
• 3.5 几丁质酶基因的PCR探测
• 3.6 PCR产物序列分析
• 3.6.1 Men-myco-93-63菌株PCR产物序列分析
• 3.6.2 S93菌株PCR产物序列分析
• 4 讨论
• 4.1 拮抗链霉菌菌株的筛选
• 4.2 产几丁质酶生防链霉菌菌株的筛选
• 4.3 几丁质酶的PCR检测
• 5 结论
• 第二章 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63几丁质酶基因ChiC的克隆及原核表达
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂与酶
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 链霉菌孢子悬液的制备
• 2.2.2 链霉菌DNA提取：
• 2.2.3 Men-myco-93-63几丁质酶基因ChiC催化域的扩增
• 2.2.4 Men-myco-93-63几丁质酶基因ChiC催化域的克隆
• 2.2.5 E.coli质粒DNA小量提取
• 2.2.6 E.coli质粒DNA大量提取
• 2.2.7 限制酶切反应
• 2.2.8 去磷酸化反应
• 2.2.9 DNA连接反应
• 2.2.10 E.coli感受态细胞的制备
• 2.2.11 质粒DNA转化E.coli
• 2.2.12 E.coli转化子的快速鉴定
• 2.2.13 Men-myco-93-63 ChiC基因的表达及活性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 Men-myco-93-63几丁质酶基因ChiC催化域的克隆和表达
• 3.1.1 Men-myco-93-63几丁质酶基因ChiC催化域的克隆
• 3.1.2 表达载体的构建
• 3.1.3 SDS-PAGE分析
• 3.1.4 几丁质酶活性测定
• 3.2 Men-myco-93-63几丁质酶基因ChiC拼接后表达
• 3.2.1 几丁质酶基因ChiC催化域PCR扩增
• 3.2.2 几丁质酶前端序列的PCR扩增
• 3.2.3 表达载体的构建
• 3.2.4 SDS-PAGE分析
• 3.2.5 几丁质酶活性测定
• 4 讨论
• 4.1 几丁质酶催化域的克隆及E.coli表达
• 4.2 几丁质酶基因拼接表达
• 5 结论
• 第三章 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素生物合成基因簇的初步研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 链霉菌孢子悬浮液的制备
• 2.2.2 链霉菌DNA提取：
• 2.2.3 E.coli质粒DNA提取
• 2.2.4 E.coli感受态细胞的制备
• 2.2.5 质粒酶切、去磷酸化、连接
• 2.2.6 总DNA的Sau3AI不完全酶切
• 2.2.7 蔗糖浓度梯度离心
• 2.2.8 噬菌外壳蛋白包装
• 2.2.9 E.coli LE392感受态细胞制备
• 2.2.10 噬菌体转导
• 2.2.11 挑选转化子
• 2.2.12 文库的筛选
• 2.2.13 Southem印迹杂交
• 2.2.14 链霉菌质粒提取
• 2.2.15 链霉菌的原生质体制备，转化及再生程序
• 2.2.16 转化子活性检测
• 2.2.17 抗性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因文库的建立
• 3.1.1 总DNA的Sau3AI不完全酶切
• 3.1.2 DNA片段的蔗糖梯度离心
• 3.1.3 质粒载体pKC505的处理
• 3.1.4 载体与外源片段的连接、包装及侵染
• 3.1.5 文库质量分析
• 3.2 鸟枪法克隆抗生素合成基因簇
• 3.3 探针的获得
• 3.3.1 PKS类引物的合成和扩增
• 3.3.2 糖苷类引物的合成和扩增
• 3.3.3 NRPS类引物的合成和扩增
• 3.3.4 抗生素抗性基因引物的合成和扩增
• 3.4 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63β-内酰胺酶基因的克隆
• 3.4.1 质粒文库的构建
• 3.4.2 文库筛选
• 4 讨论
• 5 结论
• 全文结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢