论文摘要
【目的】①在体外细胞水平研究巨细胞病毒感染对神经干细胞（NSCs）分化的影响及其机制;②探讨巨细胞病毒感染对神经干细胞Wnt信号途径分化相关基因转录水平的影响;③研究巨细胞病毒感染对神经干细胞细胞周期蛋白cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE和细胞周期进程的影响并探讨其机制。【方法】①小鼠神经干细胞的分离培养、鉴定和分化潜能的检测:剖宫取出孕13.5d的BALB/c胎鼠脑组织,制备单细胞悬液,过滤后用含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培养基培养;传4～5代后用nestin免疫荧光鉴定;用添加2%胎牛血清的DMEM/F12分化培养基（不含EGF、bFGF和B27）诱导NSCs分化,7天后采用免疫荧光法检测（nestin）、神经元特异性烯醇酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。②MCMV感染NSCs分化培养模型的建立:用感染复数（MOI）分别为5、1和0.1的MCMV感染NSCs,并改用分化培养基进行分化培养。③观察MCMV感染分化培养NSCs形态学的变化并示踪感染过程:采用免疫荧光法分别于分化培养后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d观察NSCs及其分化细胞标记物nestin、GFAP和NSE表达的变化,并用MCMV EA示踪感染过程。④MCMV感染对NSCs分化细胞比率的影响:采用流式细胞术分别于分化培养后3d、6d和9d检测NSCs及其分化细胞比率的变化。⑤MCMV感染对NSCs Wnt信号途径分化相关基因mRNA表达的影响:采用Real-time PCR法检测分化培养后0.5、1、2、3、4和5d时NSCs Wnt信号途径上游基因Wnt-3、Wnt-7a和下游基因Ngn-2、c-myc及CyclinD1 mRNA水平的动态变化。⑥MCMV感染对NSCs cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE和细胞周期进程的影响:用感染复数（MOI）分别为5、1和0.1的MCMV感染NSCs,并用含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培养基继续培养,采用Cyclins/DNA双参数流式细胞术检测感染细胞cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE的表达和细胞周期时相的动态变化。【结果】①成功体外分离培养NSCs,NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记nestin表达阳性,并可进一步分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。②分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,甚至崩解死亡;细胞nestin表达下调缓慢,显著高于对照组,GFAP和NSE表达显著低于对照组（P<0.05）,分化细胞中可检测到MCMV EA（早期抗原）的阳性表达。③分化培养后3～9d,感染组Nestin阳性细胞比率均显著高于对照组（P<0.05）,而GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于对照组（P<0.05）,并随MOI增加差异越明显。④分化培养后,感染组Wnt-3 mRNA的表达水平在第1～2d显著低于正常对照组（P<0.05）,其后逐渐升高但未超过正常水平;感染组Wnt–7a和Ngn-2 mRNA水平分别在第0.5～2d和第1d明显低于正常组（P<0.05）,均至第3d开始升高,但其总体峰值水平均低于正常组;感染组c-myc mRNA水平在第1～4d显著低于正常组（P<0.05）;感染组CyclinD1 mRNA水平在第0.5～1d明显低于正常组,在第2d（MOI=5）和第3d（MOI=5、1、0.1）高于正常组（P<0.05）;这五种基因表达变化的幅度随MOI的增加而增大。⑤感染后,NSCs cyclinA、cyclinB1、cyclinD1和cyclinE的表达均上调,其中MOI=0.1表达逐渐上升,在第6d达峰值,MOI=1组表达高峰在第4d,MOI=5组表达高峰在第3d;感染组G0/G1期细胞比率减少,S期和G2/M期细胞比率显著增加,出现S期和G2/M期阻滞,并随MOI的增加变化越明显。【结论】①MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少,分化发育过程中的神经元和星形胶质细胞对MCMV易感。②MCMV可下调NSCs Wnt信号途径分化相关基因Wnt-3、Wnt-7a、Ngn-2、c-myc的表达并干扰CyclinD1基因表达,这可能是MCMV感染抑制NSCs分化的重要作用机制。③MCMV抑制NSCs分化的效应及对其Wnt信号途径分化相关基因表达的影响与MOI大小存在一定量效依赖关系,MCMV可通过干扰分化相关基因的表达来抑制NSCs分化,可能与CMV感染致脑发育异常密切相关。④MCMV可上调cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE的表达,诱导NSCs从G0/G1期进入S期,出现S期和G2/M期偏移和阻滞,影响NSCs细胞周期进程,并与MOI存在一定量效依赖关系,这可能是CMV抑制NSCs增殖的主要原因。⑤CMV感染对NSCs细胞周期进程和分化的抑制作用可能是先天性CMV感染致脑发育异常的重要机制。
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