论文摘要
研究背景:卵巢癌是妇科肿瘤首位致死性疾病,晚期患者的5年生存率始终徘徊在15%～20%,肿瘤细胞对于化疗药物产生耐药性是造成这一状况的主要原因之一。铂类是治疗卵巢癌的一线化疗药物,临床卵巢癌对于铂类药物耐药已有明确的认识和定义。然而,有关铂类耐药机制的阐明却远远不足。目前从基因水平对于肿瘤耐药机制的认识已经相对深入,但多数研究的结果表明,多种耐药相关基因在卵巢癌中的表达并不能良好地预测肿瘤的耐药和预后,mRNA的丰度与其相应的蛋白质水平的表达具有不一致性可能是主要的原因之一。蛋白质组学技术为从蛋白质表达水平深入研究耐药基因的功能提供了可能性。蛋白质组学技术是一项新兴的实验技术,广泛应用于生物学研究的各个领域。总体上看,该项研究技术主要包含以下几个内容:1.表达蛋白质组学;2.功能蛋白质组学;3.结构蛋白质组学。目前,蛋白质组学技术在卵巢肿瘤研究中的应用主要集中于卵巢癌的早期诊断和筛选肿瘤标志物等方面。从临床组织入手直接研究铂类耐药机制,存在异质性、影响因素复杂、阳性结果易丢失等诸多困难。因此,以细胞系为研究对象,逐步延伸到临床成为迄今研究耐药机制的主要方法之一。本研究旨在采用蛋白质组学技术寻找卵巢癌耐药相关候选蛋白。在诱导获得分别耐受顺铂和卡铂的人卵巢上皮癌细胞系SKOV3和A2780的基础上,首次采用蛋白质组学技术,对多个铂类敏感和耐药的细胞系进行比较蛋白质组分析,寻找耐药相关的差异表达蛋白。通过对候选蛋白的生物学和功能鉴定确认其与铂类耐药的相关性,并在临床组织学标本中得到验证。进一步对耐药相关候选蛋白导致细胞对铂类耐药的机制进行探讨。研究方法:1.分别采用顺铂大剂量冲击和小剂量间歇诱导法诱导卵巢上皮癌铂类敏感细胞系SKOV3,建立顺铂耐药细胞系SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80。获得卵巢上皮癌铂类敏感及分别耐顺铂和卡铂细胞系A2780,以及SKOV3耐卡铂细胞系。分别检测上述细胞的生物学特性、耐药性、以及部分耐药相关基因的表达。2.分别提取上述各株铂类敏感及耐药细胞系的总蛋白质。采用双向凝胶电泳技术（2-DE）,考马斯亮蓝染色,图像分析软件分析,实验重复3次,识别差异表达蛋白质。胶内酶切,基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定蛋白质。定量PCR、Western blot法分别验证耐药相关候选蛋白在各细胞系中mRNA水平、蛋白质水平的表达。3.利用基因工程技术,分别构建表达正义及反义耐药相关候选蛋白的真核表达质粒,通过脂质体介导质粒DNA稳定转染各细胞系,G418筛选获得稳定转染克隆,检测转染前后细胞的生物学特性和耐药性的改变。4.分别将亲本和转染了正义耐药相关候选蛋白质粒的SKOV3细胞接种裸鼠体内,比较顺铂腹腔化疗对动物体內成瘤性的影响。5.采用免疫组化的方法,分别检测临床卵巢癌对铂类化疗敏感（n=21）和耐药（n=21）患者的病理切片中耐药相关候选蛋白的表达。利用等级资料的秩和检验,分析化疗敏感及耐药患者候选蛋白表达量的差异。采用log-rank检验分析候选蛋白的表达与肿瘤无瘤生存期的关系。6.耐药机制的研究方法包括,MTT法检测转染细胞对紫杉醇、表阿霉素的IC50和RI,以验证耐药相关候选蛋白的特异性。通过免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察耐药相关候选蛋白在细胞内的定位。采用电感偶合等离子质谱检测转染细胞内的铂含量和铂-DNA的结合量。以Western blot法观察转染细胞的p53变化。利用超滤法浓缩细胞培养上清后,Western blot法检测细胞外耐药相关候选蛋白的表达。研究结果:1.历时16个月诱导卵巢癌顺铂耐药细胞,SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的耐药指数分别为4.1±2.0和11.5±3.2,小剂量间歇诱导法的耐药指数高于大剂量冲击诱导法。SKOV3/CDDP-80细胞的形态、生长和耐药基因的表达均较SKOV3和SKOV3/CDDP-P有明显不同。SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP的耐药指数分别为3.0±0.2、3.5±0.8、3.5±0.7。在实验过程中所有耐药细胞的IC50和RI无明显改变,耐药性很稳定。2.发现卵巢癌耐药细胞系与其亲本细胞共有62个差异表达蛋白质点,利用MALDI-TOF-MS成功的鉴定了57个蛋白质点。它们的功能分别与能量代谢、核苷酸代谢、氧化还原作用、分子伴侣、信号转导、细胞骨架调节等相关。其中5种蛋白质（AnnexinA3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin 1）在三种以上耐药细胞中均差异表达。AnnexinA3和Destrin在全部耐药标本中表达均上调,IDHc在四种耐药细胞中均下调;GST-omega 1除了在SKOV3/CBP中表达无改变外,在其余三种细胞中均表达上调;而Cofilin 1在SKOV3的两种耐药细胞中表达下调,在A2780的耐药细胞中却皆上调。3.在上述五种共表达的差异候选蛋白质中,Annexin A3蛋白的表达量差异最为显著,在耐药细胞中上调了3～20倍。经过定量PCR、Western blot法验证,Annexin A3的mRNA和蛋白质表达水平与比较蛋白质组分析获得了一致的结果,从而被最终确定为本研究的耐药相关候选蛋白。4.将正义AnnexinA3质粒转染铂类敏感的细胞系后,耐药指数上升2～4倍,生长和增殖受到抑制。将反义Annexin A3质粒转染铂类耐药的细胞系后,耐药指数下降2倍左右,生长和增殖加快。细胞形态均无明显改变。5.裸鼠成瘤实验的结果表明,给予顺铂化疗后,与亲本的SKOV3细胞相比,转染正义Annexin A3质粒的细胞移植瘤生长减慢,成瘤体积缩小,抑瘤率明显降低。至观察结束时,SKOV3组移植瘤抑瘤率为（76.9±22.5）%,而SA4组移植瘤抑瘤率为（28.5±13.7）%,两组有统计学差异（P=0.002）。6.免疫组化染色比较化疗敏感及耐药患者肿瘤标本中的Annexin A3表达量,U值=139,P值=0.035,具有明显差异,AnnexinA3在化疗耐药患者中的表达量明显增高。比较无瘤生存期,AnnexinA3高表达患者平均11.3月（95%可信区间=4.0～18.0月）;Annexin A3低表达者平均16.0月（95%可信区间=5.9～26.1月）;二者具有显著性差别（P值=0.012）。7.转染正义或反义Annexin A3质粒的细胞对紫杉醇和表阿霉素的耐药性均无明显改变。在细胞浆和细胞核中均可检测到AnnexinA3的表达。在AnnexinA3过表达的细胞,胞浆内铂浓度明显降低,与DNA结合的铂明显减少,铂的排出率明显升高;经CDDP作用后p53表达的增幅较小。在Annexin A3低表达的细胞,胞浆内和与DNA结合的铂浓度均明显升高,CDDP作用后p53表达的增幅较大。Annexin A3可被分泌到细胞外,其分泌量随着细胞内Annexin A3表达的升高而增加;经CDDP作用后可观察到分泌量的增加。结论:1.两种方式诱导卵巢上皮癌细胞系SKOV3均可获得稳定的铂类耐药细胞系。大剂量冲击诱导方式模拟临床的化疗过程,但耐药性的产生低于小剂量间歇诱导法,其耐药指数可能更接近于机体内情况。SKOV3细胞对铂类耐药性的产生与已知铂类耐药相关基因的表达不具有明显的一致性。2.2-DE结合MALDI-TOF-MS技术可以有效地识别和鉴定卵巢癌化疗敏感和耐药细胞系之间差异表达的蛋白质。本研究共发现Annexin A3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin 1等五种在三株以上耐药细胞中差异表达的蛋白质,其功能涉及到多种生理代谢和调节过程,提示卵巢癌对于铂类耐药是多方面多途径的。3.Annexin A3蛋白在上述五种耐药相关候选蛋白中以其在全部耐药细胞系中的共表达、上调幅度明显、同时获得了mRNA和蛋白质表达水平的验证,被确定为本研究的目标耐药候选蛋白。4.采用基因工程技术分别将正义或反义Annexin A3质粒转染铂类敏感和耐药细胞后,观察到细胞对铂类耐药性的相应增加或减小,验证了Annexin A3蛋白与铂类耐药的相关性。5.动物体内成瘤实验将转染了正义Annexin A3质粒的SKOV3细胞接种裸鼠体内后,与亲本细胞组相比,肿瘤生长减慢,成瘤体积缩小,移植瘤抑制率明显降低,表明Annexin A3在动物体内仍能发挥其耐顺铂的作用。6.免疫组化染色的结果显示,AnnexinA3在临床化疗耐药患者中的表达量明显增高;AnnexinA3高表达患者的无瘤生存期明显低于低表达者;从而在人体进一步验证了Annexin A3是一种铂类耐药相关蛋白。7.转染正义Annexin A3质粒的卵巢癌细胞对于顺铂和卡铂的体外耐药性均明显增加,但对于紫杉醇和表阿霉素的耐药性无明显改变,提示Annexin A3可能是一种特异的铂类耐药相关蛋白。这一蛋白可以定位于细胞浆和细胞核,其表达增强造成化疗时细胞内的铂浓度降低,与DNA相结合的铂减少,致使卵巢癌细胞p53活化程度降低,凋亡减少,细胞对于铂类化疗耐受。本研究在细胞外检测到Annexin A3的表达,为进一步在外周血寻找铂类耐药标记物打下了实验室基础。