HCC中PCDH10甲基化与HBV的相关性探讨

论文摘要

肝细胞型肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）以其恶性程度高，病情进展快为特点[1]，致死率分别占我国男、女性恶性肿瘤死亡构成比的第三和第四位[2]。因此，为降低HCC的发病率和死亡率，迫切需要对HCC进行早期诊断和预防，并在此基础上进一步探讨新的治疗策略。肝癌的发生是机体肝细胞内基因组遗传学和表观遗传学水平的累积异常相互协调作用的结果[3-6]。作为诱导肝细胞癌形成的最危险的致病因子[7,8]，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染常与机体内发生的表观遗传学改变密切相关。由HBV编码的癌蛋白HBx介导的抑癌基因（tumor suppressor gene，TSG）启动子区发生高甲基化是导致多类TSG失活的重要机制[9,10]，这些基因启动子发生高甲基化是肿瘤发生过程中的关键。因此，鉴定由HBV/HBx介导的甲基化分子生物学标记物对HBV感染相关性HCC的早期监测、诊断及靶向治疗均具有重要意义。人类PCDH10基因，即OL-protocadherin，位于4q28.3，是新被界定的一类钙粘蛋白亚家族中一员，具有维持同源细胞之间粘附性的重要作用[11,12]。研究表明，PCDH10是一类新型的抑癌基因，PCDH10高表达具有显著抑制人类多种肿瘤细胞生长、恶化、浸润和转移的生物学功能[13]。PCDH10基因所在的位点经常在肝癌，结肠癌，前列腺癌和胰腺癌[14-17]等多类肿瘤中缺失。目前，PCDH10基因启动子区在多类肿瘤中存在高甲基化，在肝癌中发生甲基化失活亦有初步报道[13]，但是关于慢性HBV感染或HBx与PCDH10基因发生甲基化之间的关系至今尚未研究。本课题拟以各种肝癌细胞株、肝癌组织和表达HBx蛋白的HepG2为研究模型，采用逆转录PCR（RT-PCR）及荧光定量逆转录PCR（FQRT-PCR）技术、甲基化特异性PCR（MSP）、亚硫酸盐基因组测序（BGS）等技术，研究表观遗传调控因子HBx与PCDH10基因启动子发生甲基化、转录下调的相关性，从而为HBV感染致肝癌的机制研究提供新的方向和思路。研究结果显示：相比正常肝组织，PCDH10基因的mRNA在9株人肝癌细胞中表达下降，其中在人肝癌细胞株HepG2、Huh4、Huh7和Snu449细胞中PCDH10基因转录完全失活，在Huh1、Huh6、Mahlavu、PLC/PRF/5和Snu397细胞中PCDH10mRNA水平呈不同程度下降。运用去甲基化药物Aza处理HepG2细胞可以部分下调PCDH10的甲基化程度，从而恢复PCDH10基因的mRNA表达。临床组织标本检测结果显示：50例肝细胞癌患者癌和对应癌旁组织及6例正常对照肝组织中PCDH10的甲基化比率分别为76%（38/50）、40%（20/50）和0，相应地，PCDH10mRNA水平下调的比率依次为64%（32/50），30%（15/50）和0。HCC癌组织（p＜0.01）、癌旁组织（p＜0.05）中PCDH10转录水平下降均与PCDH10启动子发生不同程度高甲基化相关。通过进一步对23例HBV阳性HCC患者和27例HBV阴性HCC患者的癌组织进行分析，我们发现，HBV感染与PCDH10的转录水平表达下降具有明显相关性（p＜0.01），而与PCDH10启动子甲基化状态无关（p＞0.05）。同时，在Ad-HBx感染的HepG2细胞中，HBx表达也未对PCDH10启动子甲基化程度产生影响。另外，结合所研究肝癌患者的临床资料进行统计，我们发现，临床组织标本中PCDH10的甲基化状态与HCC患者年龄、性别、饮酒史、HBV感染状态及肝硬化无关（p＞0.05）。而与患者AFP水平、肿瘤大小、分期（p＜0.05）及浸润转移（p＜0.01）有明显的相关性。因此，甲基化PCDH10有望作为评估HCC预后及临床转归的潜在分子生物学标志物。本课题由国家自然科学基金（81071621、30973378）资助。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 肝癌中 PCDH10 基因表达及甲基化状态的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 HCC 中 PCDH10 甲基化失活与 HBV 感染或 HBx 基因的相关性研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 文献综述 HBV 与 HCC 中异常表观遗传学修饰的相关性研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文