严重烫伤内毒素血症大鼠胰岛β细胞功能不全与NF-κBp65基因表达相关性研究

论文摘要

目的:机体遭受创伤或手术后,存在创伤后高血糖,高血糖可促进感染和多器官功能不全综合征（multi-organ dysfunction syndrome,MODS）发生与发展,预后不良。胰岛β细胞在葡萄糖代谢中发挥着重要作用。研究创伤后胰岛β细胞功能及其免疫损伤机理非常重要。本研究以正常大鼠和严重烫伤内毒素血症大鼠为模型,运用高糖钳夹技术检测各组大鼠胰岛β细胞体内功能状态,用胶原酶消化法分离大鼠胰岛,观察体外胰岛β细胞功能;并观察严重烫伤内毒素血症大鼠胰腺组织核转录因子-кBP65（Nuclear transcription factor–κappaBP65, NF-кBP65）基因表达和血清炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）变化,以探讨胰岛组织NF-кBP65基因表达与胰岛功能不全的关系,及其可能存在的分子免疫损伤机制,为临床防治创伤性高血糖及其危害提供理论和实验依据。方法:选择普通级健康成年S（DSprague-Dawley）大鼠72只,体重250-300g,雌雄不限,将大鼠随机分为正常组（n=12）,实验组（n=60）,各组大鼠分笼饲养,自由获得鼠食和水。正常组大鼠不进行任何处理,实验组大鼠采用改进型Walker和Mason法制作30%体表面积（30%TBSA）III度烫伤模型,并2小时后腹腔注射内毒素。实验组大鼠于烫伤后12h﹑1d﹑3d﹑5d﹑7d和正常组大鼠分两组进行如下实验:1.正常组（n=6）和烫伤内毒素血症组各时相点（n=6）大鼠空腹状态采用颈动脉采血,离心收集血清于-70℃保存,用ELISA方法测TNF-α和IL-1β;并进行高糖钳夹技术,观察胰岛体内功能变化;2.正常组（n=6）和烫伤内毒素血症组各时相点（n=6）大鼠空腹状态取大鼠胰腺组织用于:⑴胶原酶消化法分离胰岛,采用葡萄糖和L-精氨酸刺激的胰岛素释放试验,观察体外胰岛功能;⑵10%福尔马林组织固定保存,分别做HE染色和免疫组织化学染色,观察胰腺组织胰岛结构变化,胰岛素（Ins）及NF-κBP65蛋白表达情况;⑶取胰腺组织匀浆,匀浆液离心后取上清液于-70℃保存,观察胰腺组织胰岛素含量变化。结果:1.严重烫伤内毒素血症大鼠模型建立情况⑴经病理切片证实,烫伤创面病变符合III度烫伤;⑵与正常组比较,实验组大鼠血糖和血清胰岛素于伤后均明显升高﹙p﹤0.05﹚。2.严重烫伤内毒素血症大鼠胰岛β细胞功能变化⑴稳态模式评估法胰岛素分泌指数（HOMA-β）和高糖钳夹技术检测胰岛β细胞体内功能表明,实验各组功能均低于正常组﹙p﹤0.05﹚;⑵原代分离胰岛检测胰岛体外功能表明,实验组大鼠与正常组比较胰岛功能下降﹙p﹤0.01﹚。3.胰腺组织匀浆液和Ins免疫组化观察胰腺组织胰岛素含量结果表明,与正常组比较,实验组大鼠均有升高﹙p﹤0.01或p<0.05﹚,但相对其血糖水平却下降。4.与正常组比较,实验组大鼠胰腺组织NF-κBP65蛋白表达明显增加,受其调控的血清TNF-α和IL-1β水平明显升高﹙p﹤0.01﹚。5. TNF-α和IL-1β与胰岛体内功能也呈显著负相关﹙p﹤0.01或0.05﹚,NF-кB阳性率与胰岛体外功能呈显著负相关﹙p﹤0.01﹚。结论:1﹑严重烫伤内毒素血症大鼠存在胰岛β细胞功能不全;2﹑NF-кB基因过度表达及血清炎症因子升高在严重烫伤大鼠胰岛功能不全中可能发挥重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试剂与材料
• 2.2 主要溶液成分及配制
• 2.2.1 用于胰岛分离的缓冲液、消化液及胰岛染液配制
• 2.2.2 大鼠模型制作所需液体
• 2.3 主要仪器与设备
• 2.4 实验动物
• 2.5 研究方法
• 2.5.1 实验动物模型建立
• 2.5.1.1 实验动物分组及烫伤模型的制作
• 2.5.1.2 烫伤模型大鼠皮肤取材
• 2.5.2 大鼠胰岛β细胞体内功能实验
• 2.5.2.1 高葡萄糖钳夹实验
• 2.5.2.2 HOMA-β指数测定
• 2.5.3 大鼠胰岛β细胞体外功能实验
• 2.5.3.1 大鼠胰岛细胞的分离纯化
• 2.5.3.2 胰岛数量和活率的评估
• 2.5.3.3 Glucose 和L-Arginine 刺激胰岛素释放试验
• 2.5.4 胰腺组织胰岛素含量分析
• 2.5.4.1 胰腺组织匀浆液制备
• 2.5.4.2 免疫组化检测胰腺组织Ins 含量
• 2.5.5 血及培养液标本相关指标测定
• 2.5.5.1 血糖和胰岛素测定
• 2.5.5.2 血清TNF-α和IL-1β测定
• 2.5.6 HE 染色病理学检查
• 2.5.7 免疫组化NF-κBp65 检测
• 2.5.8 统计学分析
• 第3章 结果
• 3.1 严重烫伤内毒素血症大鼠模型
• 3.2 各组大鼠胰岛β细胞体内和体外功能变化
• 3.3 各组大鼠胰腺组织Ins 含量变化
• 3.4 各组大鼠胰腺组织NF-кB 基因表达活化情况
• 3.5 HE 染色胰腺组织病理变化
• 3.6 各组大鼠血清TNF-α和IL-1β变化情况
• 3.7 各组大鼠胰岛功能与相关损伤指标相关性分析
• 第4章 讨论
• 4.1 有关严重烫伤内毒素血症动物模型制作
• 4.2 严重烫伤内毒素血症大鼠胰腺组织NF-КBp65基因表达和血清TNF-α和IL-1β变化及其意义
• 4.3 炎症细胞因子对胰岛的损伤
• 4.4 严重烫伤内毒素血症大鼠血糖及其血清和胰腺组织储存池Ins含量变化
• 4.5 严重烫伤内毒素血症大鼠体内和体外胰岛功能变化
• 4.6 相关损伤指标与胰岛功能相关性分析
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果