人IL-28和IL-29基因的克隆与表达

论文摘要

白细胞介素（IL）-29、IL-28A和IL-28B是2003年初发现的一个新型的细胞因子家族，由于其结构和功能与干扰素（IFN）有一定的相似性，所以它们也分别被称为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。它们是由一些病毒或双链RNA（dsRNA）活化多种细胞如外周血单个核细胞和树突状细胞等产生的细胞因子。其信号转导机制类似于Ⅰ型干扰素，两者都是通过诱导受体异二聚体化，活化Jak-STAT信号通路，进而发挥其抗病毒感染、抑制细胞增殖和免疫调节等生物学作用。所不同的是IL-28和IL-29是通过诱导其独特的Ⅰ型细胞因子受体CRF2-12（或称IFNLR1、IL-28Rα、LICR2）和CRF2-4（或称IL-10Rβ、IL-10R2）异二聚体化进行信息传递。IL-28和IL-29与Ⅰ型IFN有相似的功能，而且能选择性地作用不同类型的靶细胞，它们可作为IFN的替代品，用于肿瘤和病毒性疾病等的治疗。最近的研究表明，IL-28和IL-29还能诱导CD4+CD25+Treg调节性细胞的增殖及耐受性树突状细胞的产生，在肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病及变态反应性疾病等的防治方面具有潜在的应用价值。 目前，国内还没有重组基因工程IL-28和IL-29上市，而且其功能研究在国内外都尚处于起步阶段。本研究拟克隆人IL-28和IL-29基因，通过真核和原核表达系统表达IL-28和IL-29蛋白，奠定基因工程研制重组人IL-28和IL-29的基础。主要研究结果如下： 一、根据GenBank中人IL-29、IL-28A和IL-28B基因序列设计特异性引物，用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）技术，从聚肌胞（poly I：C）刺激的人外周血单个核细胞中克隆出IL-29、IL-28A和IL-28B基因的全长编码区，并将之克隆入pcDNA3.1／V5-His-TOPO载体，分别构建其基因的真核表达载体pcDNA3.1／V5-His-TOPO-IL-28／IL-29，转化入大肠杆菌TOP10中，经菌落PCR、酶切鉴定及序列测定与分析，它们与GenBank中的序列完全一致。同时，发现了一个新的基因序列，它与IL-28B有5个碱基不同，把它暂时命名为IL-28C。用计算机技术和分子生物学软件对IL-29、IL-28A和IL-28B的二级结构特征和B细胞抗原表位进行了分析和预测，发现它们的结构与抗原表位具有很大的相似性，预示着它们具有相似的生物学功能。为IL-29、IL-28A和IL-28B基因的表达研究奠定了基础。 二、为了研究IL-29、IL-28A和IL-28B的功能，本研究将含有IL-29、IL-28A和IL-28B全长cDNA片段的真核表达质粒，用LipofectamineTM2000脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞，经抗生素G418筛选后，通过RT-PCR和Western-blot鉴定IL-29、IL-28A和IL-28B

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 1 IL-28和 IL-29发现与命名
• 2 IL-28和 IL-29基因结构
• 3 IL-28和 IL-29蛋白结构
• 4 IL-28和 IL-29产生及调节
• 5 IL-28和 IL-29受体及信号转导
• 5.1 受体基因结构及表达
• 5.2 受体蛋白结构
• 5.3 信号转导途径
• 6 IL-28和 IL-29生物学活性
• 6.1 抗病毒活性
• 6.2 抗细胞增殖活性
• 6.3 免疫调节活性
• 7 本研究的目的和内容
• 第1章 人IL-28A、IL-28B和 IL-29 cDNA克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 人 PBMC的诱导和总 RNA制备
• 2.2 RT-PCR扩增
• 2.3 质粒构建
• 2.4 菌落 PCR鉴定
• 2.5 限制性酶切鉴定
• 2.6 序列测定
• 2.7 生物信息学分析
• 3 讨论
• 3.1 克隆 IL-28和 IL-29基因的意义
• 3.2 本研究的特点与可靠性
• 3.3 生物信息学分析
• 参考文献
• 第2章 人 IL-28A、IL-28B和 IL-29在真核细胞中表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 A549细胞培养及质粒转染
• 2.2 质粒转染效率
• 2.3 RT-PCR分析
• 2.4 Western blot分析
• 2.5 抗病毒活性
• 3 讨论
• 参考文献
• 第3章 人 IL-29在原核细胞中表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 融合蛋白的诱导表达
• 2.3 重组蛋白的纯化
• 2.4 IL-29的活性鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第4章 人 IL-28A在原核细胞中表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 重组蛋白的表达
• 2.3 重组蛋白的纯化
• 2.4 重组 IL-28A的鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 6-IL-29在原核细胞中表达'>第5章 人 His₆-IL-29在原核细胞中表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 PCR扩增
• 2.2 质粒构建
• 2.3 菌落 PCR鉴定
• 2.4 酶切电泳鉴定
• 2.5 序列测定
• 2.6 重组蛋白的诱导表达
• 2.7 重组蛋白的纯化与鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 附录
• 综述
• 博士期间发表的文章及获得的成果
• 个人简历
• 致谢