论文摘要
结核病（tuberculosis, TB）是严重危害人类健康的传染性疾病。WHO的统计数字显示,2011年全球共有新发结核病例数870万,包括31万耐多药结核病例（Multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB）,因结核病死亡的病例数高达140万。中国是22个结核病高负担国家之一,病例总数居全球第二,耐药病例数世界第一。结核分枝杆菌北京型家族菌株（下称北京菌株）是我国结核病的主要致病菌,该菌株大多分布于东南亚地区,但随着亚洲人口的迁移,北京菌株已遍布全球,是一百多年来扩张最快的结核菌家族。课题组前期通过复制、重组、修复相关的3R基因（Replication, Recombination, and Repair）单核苷酸多态性位点（Single Nucleotide Polymorphism, SNPs）分型技术,将北京菌株进一步细分为7种亚型,并发现最近分化（5,000-6,000年前）的Bmyc10亚型在我国人群中的分布占主要地位（约80%）,而种系发生关系上与之相邻的Bmyc26亚型在人群中的比例不足1%。这两个种系关系相近的结核菌亚型为什么会出现如此悬殊的流行差异,是本论文研究的第一个问题。为了揭示Bmyc10菌株在人群中广泛分布的分子机制,我们根据全国6县级地区1448株结核菌的3R基因SNPs以及16位点数目可变串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeats, VNTR）基因分型结果,挑选了35株代表5种北京菌株亚型的临床菌株用作高通量全基因组测序。联合4株在全球范围发现并已公布基因组序列的北京菌株和结核菌标准菌株H37Rv,我们构建了北京菌株各亚型的种系关系发生树,以此鉴定Bmyc10亚型特异的SNPs位点和插入缺失序列（Insertions and Deletions, Indels）。种系发生树的结构显示,目前引起广泛关注的北京菌株均属于Bmyc10亚型。对该亚型突变基因的功能相似性分析结果提示,这些基因在细胞定位上偏好于细胞膜和细胞壁等与宿主频繁接触的区域。通过位点保守性、正选择分析等方法,我们鉴定出11处可能对基因功能有重要影响的遗传突变。参考结核菌在134种应激条件下的转录组学数据,我们发现诱导这些突变基因上调的应激条件为自由脂肪酸以及反应氧/氮化合物损伤,这与结核菌在宿主巨噬细胞内的生存环境十分相似。因此,我们的分析结果提示,Bmyc10亚型特异的遗传突变很可能以多个突变基因协同作用的方式,增强了该亚型菌株对宿主巨噬细胞内应激条件的适应性。这些适应性突变的积累,为此后Bmyc10亚型的扩张奠定了重要的遗传基础。流行病学研究提示,耐多药结核病的产生与传播是结核病在某些地区广泛流行的主要原因,然而,结核菌获得性耐药的形成机制目前尚不清楚。在本论文的第二章,我们将研究方向转向了Bmyc10菌株在临床治疗过程中的微进化过程,其中结核菌获得性耐药的形成过程是我们重点研究的问题。为了研究在治疗压力下,结核菌从全敏感发展为耐多药结核的微进化过程,我们从上海疾病预防控制中心（下称上海疾控中心）选取了3例结核病患者的7份痰菌样本作全基因组测序。经过以似然比检验（Likelihood Ratio Test, LRT）为核心的分析流程,我们发现每例测序样本具有8-41处频率大于5%的不固定突变,提示体内的结核菌群体具有丰富的遗传多样性。接着,在对耐药相关基因更为细致的分析中,我们发现多达4-5种耐药突变在耐药形成过程中被筛选,这说明结核菌有能力选择多种耐药突变应对多药联用的抗结核治疗方案。最终,随着治疗的持续进行,只有一种耐药突变被保留,提示不同的耐药菌亚群之间存在相互竞争（克隆干扰）的关系。结核菌克隆干扰的发现,强调了早期诊断、及时治疗对预防获得性耐药的重要意义。此外,我们还发现了19处在治疗过程中频率发生显著变化的基因组突变,其中的14处突变可能增强了耐药结核菌对体内环境的适应能力。结核菌体内遗传多样性的发现,对其适应性进化的理论研究具有重要意义,然而,这一发现的临床应用价值仍有待探索。第二章的研究中,我们发现有效的治疗方案,使痰菌样本中的特征性突变减少,而当治疗方案无效时,高通量测序检测到的突变数量增加,这提示痰菌样本的遗传多样性可能与结核病患者的疗效相关。随着测序成本的不断下降,全基因组测序有望替代当前的痰液检测手段,成为指导临床用药,监测治疗效果的常规检验方法。定量监测结核菌遗传多样性变化并探索与治疗转归的联系,因此成为第三章研究的重点问题。为了初步探讨治疗效果与痰菌样本遗传多样性的联系,我们从河南省胸科医院的菌种库中选取了1例耐多药复治病例在治疗前,以及治疗后第2、4、6、8、16周的痰菌样本,并对这些样本进行了1,000倍以上的高深度测序。治疗记录显示,在药敏测试结果不详的前4周里,患者接受了无效的治疗方案,而第5周后二线抗结核药阿米卡星的应用,使痰液菌载量略为下降。与此相应,我们在治疗前4周的3例痰菌样本中发现特征性突变从33持续上升至50SNPs/103倍测序深度,而第6周的样本中,突变数量又骤降至25SNPs/103倍测序深度,下降趋势一直延续至第16周。这一结果提示,“治疗无效,多样性上升；治疗有效,多样性下降”的科学假设很可能是成立的。接着,通过鉴定治疗过程中频率发生显著性变化的基因组突变,我们发现仅有一处同义突变的频率持续上升。虽然没有改变蛋白质一级结构,但该突变使编码天冬氨酸密码子的偏好性提升了2倍,说明同义突变可能通过改变密码子使用偏好性影响了突变蛋白的表达水平。最后,我们发现阿米卡星主要的杀菌效应只维持了不到1周的时间。由于治疗期间并没有阿米卡星耐药相关突变出现,我们推测结核菌的表型耐药是治疗失败的主要原因。这一结果提示,高通量技术也可以用于结核菌表型耐药的检测和评估,为将来的个性化治疗提供用药指导。综上所述,本论文通过高通量测序技术,研究了北京菌株Bmyc10亚型在不同时空尺度下的进化过程。通过对痰菌样本遗传多样性的定量监测,我们还初步探讨了高通量测序对指导用药,评估疗效的可行性。本研究的结论不仅对结核菌微进化的理论研究有参考价值,也有望为高通量测序技术的临床应用指出一条新的方向。