论文摘要
目的:骨质疏松症（osteoporosis,OP）是目前世界人口老龄化重点防治的病症。骨质疏松症的严重后果是骨折,骨质疏松性骨折（Osteoporotic fracture,OPF）存在不愈合或延迟愈合的危险,严重影响患者身体健康与生活质量,甚至会致残、致死。OPF以粉碎性骨折居多,骨折部位骨的质量降低,强度变弱,治疗十分困难,医疗费用非常惊人。尽管近年来在防治OP方面已取得了很大的成就,但至今仍未找到令人满意的防治OPF方法。因此,防治OPF是当今研究的热门课题。关于促进OPF愈合的药物,现代医学主要应用雌激素替代疗法、氟化物、双膦酸盐、降钙素和钙制剂等,虽有一定疗效,但有相当大的副作用,能否长期服用一直存在争议。中医中药在促进OPF愈合方面的进展逐渐为医药学者所重视。从临床症状上看OPF可归属为中医学中“骨痿,骨疲”范畴,根据“肾藏精,精生髓,髓养骨”,认为OPF与中医的“肾”有非常密切的关系。本研究是在建立去卵巢Wistar大鼠骨质疏松骨折模型的基础上,用中药密骨方（Migufang,MGF）进行干预,通过免疫组化、分子生物学等实验方法,探讨雌激素缺乏时产生OPF在骨折愈合过程中的相关因子在不同时期生物学特征,以阐明MGF在去卵巢OPF骨折愈合过程中的作用机制,为中医药在防治OPF的应用开发提供实验依据。方法:1.骨质疏松骨折动物模型的建立6月龄成年雌性Wistar大鼠90只,260-300克,随机分为3组,假去卵巢对照组（Sham）30只,模型组（OVX）30只,密骨方治疗组（MGF）30只。MGF组与OVX组完整摘除双侧卵巢,Sham组只切除同量的脂肪。饲养3个月后全部在右后侧股骨中上1/3段建立闭合性骨折模型。2.给药方法:骨折固定术后,MGF组按10 mg/（kg·d）密骨方汤剂（华中科技大学同济医学院老年医药学研究所提供）灌胃,OVX组与Sham组给予同量的生理盐水,疗程为2周、4周、6周。3.观察指标及测定方法3.1血液生化的变化:术后2周、4周及6周在每组随机选取5只大鼠摘眼球取血,离心5min取血清,用放射免疫法检测血清E2、血清BGP,用生化分析仪检测血清ALP。3.2骨折愈合过程骨折端IL-6、TGF-β1的动态变化:采用SABC染色法,并用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统作图像分析。检测术后2周、4周及6周骨折端IL-6、TGF-β1的表达。3.3骨折愈合过程骨折端BMP-3、OPG的动态变化:采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法,检测术后2周、4周及6周骨折端BMP-3mRNA、OPGmRNA的表达。结果:1.血液生化的变化:1.1 MGF对去卵巢大鼠血清E2的影响（（?）±s）OVX组在各时间段均显著低于Sham组与MGF组（P＜0.05）;MGF组在第2周和第4周的血清E2均显著低于Sham组（P＜0.05）;MGF组在第6周的血清E2均显著高于Sham组（P＜0.05）;OVX组与MGF组血清E2在时间上有显著升高均势（P＜0.05）。Sham组在时间上无统计学差异（P＞0.05）。1.2 MGF对去卵巢大鼠血清BGP的影响（（?）±s）Sham组在三个时间段内无显著性差异（P＞0.05）。MFG组在三个时间段有降低趋势且有显著性差异（P＜0.05）。MFG组血清BGP值在第6周显著低于Sham组（P＜0.05）。OVX组血清BGP值在三个时间段内有升高趋势,且各组间有显著性差异（P＜0.05）。1.3 MGF对去卵巢大鼠血清ALP的影响（（?）±s）Sham组在三个时间段内无显著性差异（P＞0.05）。OVX组在第2周显著高于Sham组（P＜0.05）。MFG组血清ALP值总体比较有显著降低趋势（P＜0.05）。OVX组血清ALP值总体比较有显著升高的趋势（P＜0.05）。各组在第4周时血清ALP值最低（P＜0.05）。2.组织学观察:2.1 Sham组与OVX组的比较2.1.1骨折后2周,OVX组软骨性骨痂形成以取代纤维骨痂,早期纤维骨痂内软骨岛出现,不断扩展,血管周围软骨细胞多体积较小的圆形幼稚软骨细胞,随着时间的推移,软骨痂周边部软骨细胞大部分变性坏死,并出现少量原始（幼稚）小梁状骨,原始小梁状骨边成骨细胞数较少,原始骨小梁间为结缔组织（包括血细胞）。Sham组原始小梁状骨表面可见大量排列整齐的成骨细胞。2.1.2骨折后4周,OVX组骨痂量少,纤维结缔组织逐渐减少,软骨性骨痂逐渐增多。Sham组骨折端出现大部分骨性愈合,且有连续性骨痂包绕。2.1.3骨折后6周,OWN组软骨痂周边部继续不断为原始小梁状骨（编织骨）替代,但软骨性骨痂仍未吸收融合,仍有软骨岛出现;早期形成的原始小梁状骨内软骨细胞或变性坏死或分化、转化为骨细胞;同时,表面破骨细胞出现,并与成骨细胞相偶联,使原始骨小梁不改建成为成熟骨小梁。OVX组与Sham组相比,小梁状骨吸收快且被吸收数多,小梁间距增宽,其间充满大量脂肪细胞。Sham组此时骨折端已大部分形成骨性骨痂。2.2 MGF组与OVX组的比较2.2.1骨折后2周,MGF组膜内成骨与OVX组基本相似,在纤维性骨痂中出现软骨岛,并逐渐扩大,并在软骨痂周边出现新生骨小梁。OVX组大量纤维组织及少数纤维性骨痂形成。OWN组的软骨骨痂多于MGF组。MGF组纤维性骨痂较OVX组多见。2.2.2骨折后4周,MGF组骨痂中骨性骨痂较多,软骨细胞较少,未见到软骨岛存在,骨小梁粗细均匀一致,间距无明显增宽,板层骨形成,周围结缔组织和骨髓腔可见较多毛细血管植入。OWN组四周纤维结缔组织逐渐减少,软骨性骨痂逐渐增多。MGF已有少量成熟的骨性骨痂出现。2.2.3骨折后6周,MGF组软骨骨痂周边部新生小梁状骨不断增加,在中早期形成的原始小梁状骨内软骨细胞此时逐渐转化为骨细胞,原始骨小梁不断改建成为成熟骨小梁,骨小梁融合、粗大,软骨成分减少,软骨性骨痂已逐渐转化为成熟的骨性骨痂。OVX组软骨骨痂向骨性骨痂转化缓慢,软骨性骨痂仍未吸收融合,仍有软骨岛出现,透明样软骨仍然存在,软骨痂仍然较多。3.免疫组化结果3.1 SABC染色组织学观察:MGF组和OVX组在骨折愈合过程中TGF-β1、IL-6细胞因子的细胞定位无差别。TGF-β1主要定位于间充质细胞、吞噬细胞、成骨细胞、软骨细胞等。IL-6主要定位于成骨细胞、软骨细胞等。3.2 TGF-β1在骨折端的表达图像分析结果:Sham组TGF-β1在骨折端的表达在时间的变化上无显著性差异（P＞0.05）;OVX组TGF-β1在骨折端的表达在时间的变化上呈显著减弱趋势（P＜0.05）;MGF组TGF-β1在骨折端的表达在时间的变化上呈显著升高趋势（P＜0.05）;MGF组在4周与6周的TGF-β1在骨折端的表达结果显著高于OVN组和Sham组。3.3 IL-6在骨折端的表达图像分析结果:Sham组IL-6在骨折端的表达在时间的变化上有显著性减弱趋势（P＞0.05）;OVX组IL-6在骨折端的表达在时间的变化上呈显著升高趋势（P＜0.05）;MGF组IL-6在骨折端的表达在时间的变化上呈显著减弱趋势（P＜0.05）;MGF组在4周与6周的IL-6在骨折端的表达结果显著低于OVX组和Sham组。4.荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法的检测结果:4.1 BMP-3 mRNA在骨折端的表达大鼠骨折端OPG mRNA表达的循环数值:在时间上的总体比较呈递减的趋势并有显著性差异（F=153.19、P＜0.05）;在组别的总体比较是OVX组＜MGF组＜Sham组并有显著性差异（F=262.23、P＜0.05）;在时间与组别的交互比较也存在显著性差异（F=81.50、P＜0.05）;任两组间都有统计学差异（P＜0.05）。4.2 OPG mRNA在骨折端的表达大鼠骨折端OPG mRNA表达的循环数值:在时间上的总体比较呈递减的趋势并有显著性差异（F=124.51、P＜0.05）;在组别的总体比较是OVX组＜MGF组＜Sham组并有显著性差异（F=118.42、P＜0.05）;在时间与组别的交互比较也存在显著性差异（F=16.23、P＜0.05）;任两组间都有统计学差异（P＜0.05）。结论:MGF对去卵巢大鼠OPF有促进骨折愈合的作用。其作用机制是:有可能提高E水平促进骨形成,抑制骨吸收来调节骨代谢平衡;降低骨折断端BMP-3的基因表达及提高TGF-β1的合成分泌,刺激成骨细胞生成和分化,从而促进骨形成;降低骨折断端OPG的基因表达及降低IL-6的合成分泌,降低破骨细胞的活性,从而抑制骨吸收。总之,MGF是从促进骨形成和抑制骨吸收两方面促进OPF的骨折愈合。
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