利用毛细管电泳技术检测猪亲本与其子代DNA甲基化差异及遗传背景研究

论文摘要

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。毛细管电泳是近年来迅速发展起来的一种分离分析技术，并成功地用于基因分析。本研究通过甲基化敏感的单链构象分析法与毛细管电泳技术相结合建立一种高效、灵敏、自动化的DNA甲基化检测方法。本研究以三个纯种亲本大白猪、长白猪和梅山猪及其正反交大白猪×长白猪、长白猪×大白猪、大白猪×梅山猪和梅山猪×大白猪杂交猪为试验对象，应用单链构象多态性-毛细管电泳分析方法检测肌肉组织IGF2第二启动子甲基化状态，从不同杂交组合角度，比较了亲本与子代之间在启动子甲基化水平上的差异，并进一步结合生产性状资料进行了相关分析。获得的主要结果如下：1．建立了检测基因启动子甲基化状态的单链构象多态性-毛细管电泳分析方法。2．利用上述基于毛细管电泳的基因甲基化分析平台，测定了IGF2第二启动子与MYF5启动子的甲基化状态。3．肌肉组织中，IGF2基因第二启动子发生甲基化的比率表现为杂种猪均低于纯种猪。4．对不同品种间IGF2启动子甲基化水平的差异进行了比较，长白猪与其他六个猪种之间差异达到极显著水平（p＜0.01）。梅山猪与大梅猪之间差异达到显著水平（p＜0.05）。5．利用SAS统计学软件，对IGF2启动子甲基化水平与生产性状资料进行了关联分析：在65头大白、长白及其杂种猪中，IGF2启动子甲基化水平对一系列背膘厚性状、眼肌高、眼肌面积、肥肉率、瘦肉率相关性差异显著（p＜0.05）或极显著（p＜0.01）。对于肉质性状，IGF2启动子甲基化水平与性状的相关性不明显。6．在120头梅山及梅大、大梅杂种猪中，IGF2启动子甲基化水平与眼肌高、眼肌面积相关性差异显著（p＜0.05）或极显著（p＜0.01）。对于肉质性状，IGF2启动子甲基化水平与背最长肌含水量相关性差异显著（p＜0.05），与背最长肌pH值，背最长肌失水率，背最长肌系水率，背最长肌肌肉色值相关性差异极显著（p＜0.01）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要性状中英文对照表
• 第一部分 文献综述
• 1 前言
• 2 DNA甲基化研究进展
• 2.1 DNA甲基化的机制
• 2.2 哺乳动物DNA甲基化特点
• 2.3 DNA甲基化的生物学功能
• 2.3.1 DNA甲基化与基因表达
• 2.3.2 DNA甲基化与胚胎发育
• 2.3.3 DNA甲基化与X染色体失活
• 2.3.4 DNA甲基化与基因印记
• 2.3.5 DNA甲基化与肿瘤
• 2.3.6 DNA甲基化与哺乳动物发育
• 2.3.7 DNA甲基化与杂种优势
• 3 DNA甲基化检测技术
• 3.1 甲基化敏感的限制性内切酶法
• 3.2 亚硫酸氢钠法
• 4 毛细管电泳技术概况
• 4.1 毛细管电泳分类
• 4.2 毛细管电泳与DNA分析
• 5 候选基因概况
• 5.1 胰岛素样生长因子-2（IGF2）的研究现状
• 5.1.1 IGF2基因的定位和结构特点
• 5.1.2 IGF2的生物学作用
• 5.1.3 IGF2基因启动子的研究
• 5.2 生肌因子-5（MYF5）的研究现状
• 5.2.1 MYF5基因的定位和结构特点
• 5.2.2 MYF5的生物学作用
• 5.2.3 MYF5基因启动子的研究
• 第二部分 研究目的与意义
• 第三部分 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物DNA样
• 1.2 主要药品及试剂
• 1.3 缓冲液及常用试剂的配制
• 1.4 主要仪器和设备
• 1.5 引物
• 1.5.1 IGF2第二启动子巢式PCR引物
• 1.5.2 MYF5启动子巢式PCR引物
• 2 试验方法
• 2.1 猪IGF2与MYF5基因部分启动子片段的扩增和检测
• 2.1.1 猪基因组DNA的亚硫酸盐前处理
• 2.1.2 IGF2第二启动子PCR反应体系及条件
• 2.1.3 MYF5启动子PCR反应体系及条件
• 2.1.4 PCR产物的检测
• 2.2 猪IGF2与MYF5基因克隆和测序
• 2.2.1 PCR产物的回收
• 2.2.2 纯化的PCR扩增片段的克隆
• 2.2.3 阳性克隆子的鉴定及序列测定
• 2.3 毛细管凝胶电泳检测启动子甲基化状态
• 2.4 数据处理分析
• 第四部分 结果与分析
• 1 启动子扩增及测序结果
• 1.1 IGF2第二启动子扩增及测序结果
• 1.1.1 IGF2扩增结果
• 1.1.2 IGF2测序结果
• 1.1.3 IGF2测序结果比对
• 1.2 MYF5启动子扩增及测序结果
• 1.2.1 MYF5扩增结果
• 1.2.2 MYF5测序结果
• 1.2.3 MYF5测序结果比对
• 2 毛细管电泳结果
• 2.1 IGF2第二启动子毛细管电泳检测结果
• 2.2 MYF5启动子毛细管电泳检测结果
• 3 肌肉组织不同品种IGF2第二启动子不同甲基化水平的分类
• 4 不同品种间IGF2第二启动子不同甲基化比率的多重比较
• 5 IGF2第二启动子不同甲基化水平的遗传效应分析
• 5.1 IGF2不同甲基化水平与性状的相关性分析
• 5.1.1 大白猪、长白猪及其杂种猪IGF2不同甲基化水平与性状的相关性分析
• 5.1.2 梅山猪和大梅、梅大杂交猪IGF2不同甲基化水平与性状的相关性分析
• 第五部分 讨论
• 1 关于毛细管凝胶电泳
• 1.1 影响毛细管电泳分离效果的因素
• 1.2 毛细管电泳最佳分离条件的确定
• 1.3 毛细管电泳标样的确定
• 2 关于目的片断PCR扩增
• 3 亲子代间甲基化差异与遗传背景研究
• 4 IGF2不同甲基化水平的遗传效应分析
• 5 结论
• 6 下一步工作
• 参考文献
• 附录 1
• 附录 2
• 致谢