小鼠脑缺血再灌注后Wnt/β-catenin在海马神经干细胞增殖中的作用

论文摘要

脑缺血是人类致死、致残的主要症侯群之一,现有的治疗方法很难解决其所致的大量神经元丢失,多数脑缺血患者都有偏瘫或认知障碍等后遗症。以往认为成体神经系统不具备增殖分化能力,受损神经元无法通过自身替补更新。但是随着神经干细胞（neural stem cells,NSCs）研究的不断深入,发现多种成年哺乳动物包括人在内的脑室下区（subventricular zone,SVZ）和海马齿状回颗粒下区（subgrannular zone,SGZ）终生具有分裂增殖能力NSCs,病理性刺激可以激发SVZ和SGZ的神经细胞再生,并且增殖细胞分化为神经元和胶质细胞,提示这些神经生发区在生后的脑再生和损伤修复中起着重要作用。脑缺血虽然可以激发脑内SVZ和SGZ的神经发生,但这种能力很有限,目前内源性NSCs在缺血性脑损伤后的增殖机制尚不清楚,这是影响调控这种内源性NSCs的增殖来修复中枢神经系统损伤的关键障碍。研究表明,Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞增殖的关键途径,因此本课题建立了小鼠脑缺血再灌注模型,探讨Wnt/β-catenin信号通路在脑缺血再灌注后NSCs增殖中的作用。本课题研究包括以下二个部分:第一部分小鼠脑缺血再灌注模型的建立与鉴定本实验通过夹闭小鼠双侧颈总动脉半小时再通的方法建立了脑缺血再灌注模型。海马不同区对缺血性损伤的易感性不同,CA1区锥体细胞最敏感。采用单、双标记免疫组织化学染色和免疫荧光染色的方法检测5-溴脱氧尿苷（BrdU）和巢蛋白（Nestin）的表达。BrdU标记增殖的新生细胞,Nestin标记神经干细胞。小鼠海马BrdU +细胞在脑缺血再灌注后1天开始增加（P<0.05）, 7天达到高峰（P<0.01）,28天恢复正常水平（P>0.05）。Nestin +细胞数与BrdU +细胞数同步达到峰值,呈相同变化趋势（P<0.01）。第二部分小鼠脑缺血再灌注后β-catenin信号在海马神经干细胞增殖中的作用文献表明,结肠癌细胞中过量表达Axin会明显促进β-catenin的降解,Axin以构架蛋白的形式在Wnt信号转导途径中起负调节作用。因此我们采用分别导入目的基因β-catenin和Axin的方法上调和下调小鼠脑内β-catenin的水平来观察Wnt/β-catenin信号通路在小鼠海马神经干细胞增殖中的作用。基因转染系统分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体对导入基因的大小有限制,其转基因的效率虽较高但有免疫原性,运用于临床治疗有很大的风险。非病毒载体没有病毒载体的安全性问题,且免疫原性弱、容量大,比较适用于体内基因治疗的途径。尤其是目前发现的多价阳离子脂质体转染效率更高、几乎无免疫排斥、毒性低及方法简单。本实验采用以质粒为载体、阳离子脂质体包裹、经侧脑室导入目的基因的方法来转染含β-catenin和Axin基因的质粒,与以往将目的基因直接注射于脑组织的方法相比,导入的基因量更大,基因在颅内扩散受到的限制更小,对于动物模型的损伤更小。结果表明,注射pTRE2-Axin-eGFP质粒的缺血组小鼠海马BrdU +细胞、Nestin +细胞数、BrdU+ /Nestin+细胞数均较对照缺血组少（P<0.05）,但仍较正常组多（P<0.05）。注射pβ-cateninS33Y质粒组小鼠海马BrdU +细胞、Nestin +细胞数、BrdU+ /Nestin+细胞数均较对照缺血组多（P<0.05）。说明β-catenin信号参与了小鼠海马神经干细胞的增殖过程。结论:夹闭小鼠双侧颈总动脉半小时可建立一种简易稳定的脑缺血再灌注损伤的理想动物模型,这种损伤能使神经细胞再生得到短暂的增强,并呈现出增殖细胞升高又向正常水平回落的变化趋势。上调和下调小鼠脑内β-catenin的水平能明显增高和降低神经干细胞再生的水平,说明Wnt/β-catenin信号通路在神经干细胞增殖过程中发挥了重要作用,为通过调控内源性NSCs的增殖提供了一种新的思路。

论文目录

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• 论文正文 小鼠脑缺血再灌注后Wnt/β-catenin 在海马神经干细胞增殖中的作用
• 前言
• 第一部分 小鼠脑缺血再灌注模型的建立与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 小鼠脑缺血再灌注后Wnt/β-catenin 在海马神经干细胞增殖中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 文献综述 脑缺血后的神经发生及Wnt/β-catenin 信号通路的调控
• 参考文献
• 硕士研究生期间发表的论文