中国被毛孢甾醇提取最优条件的正交法研究

论文摘要

冬虫夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]是传统名贵中药,具有保护呼吸系统、维护肾功能、抗癌、抗氧化等作用。其无性型为中国被毛孢（Hirsutella sinensis Liu, Guo, Yu & Zeng）,具有广阔应用前景。甾醇类物质是冬虫夏草主要活性成分之一,其中麦角甾醇是真菌特征甾醇,具有显著的抗癌活性,本课题主要对中国被毛孢甾醇提取的最优条件进行研究。对磷硫铁法和香草醛-冰醋酸比色法测定总甾醇含量进行了方法学研究,2种方法显色1小时后吸光值变化幅度均小于1%,稳定性较好；精密度RSD分别为1.9%和3.6%；回收率分别为126.3±16.5%和105.4±3.6%,香草醛-冰醋酸法准确度更高；选择香草醛-冰醋酸法为中国被毛孢总甾醇含量的测定方法。单因素实验考查皂化用碱量、乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数5个因素对超声波辅助提取总甾醇的影响,发现皂化用碱量、乙醇浓度、提取次数三因素相邻水平差异显著（P<0.05）,而提取时间、料液比（除1/100外）对提取影响均无统计学显著性（P>0.05）；再以KOH/菌丝体比值分别为0、0.5、1,乙醇浓度分别为60%、80%、95%,提取次数分别为1、2、3的3因素3水平正交法优化超声波辅助提取条件,得最佳提取条件为：KOH/菌丝体比值为1,乙醇浓度为95%,提取3次,并测得总甾醇含量约为5.016%±0.205%。单因素试验显示温度对热回流提取效果影响很小；以与超声波法相同的3因素3水平正交设计对热回流法进行考察,得最佳提取条件为：回流温度50℃,KOH/菌丝体比值为0.5,乙醇浓度为95%,提取2次,每次1小时。验证试验显示,超声波法优于热回流法。建立了RP-HPLC测定中国被毛孢总麦角甾醇含量的方法,以Hypersil C18反向色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,纯甲醇流动相,上样量201μL,流速1.0mL/min,检测波长282nm,测得总麦角甾醇含量为0.08%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 冬虫夏草的成分和药理作用
• 1.1 冬虫夏草介绍
• 1.1.1 冬虫夏草的无性型的确定
• 1.1.2 冬虫夏草的甾醇类物质
• 1.2 冬虫夏草的药理作用
• 1.2.1 肾功能维护作用
• 1.2.1.1 对肾毒性损伤的治疗作用
• 1.2.1.2 对肾功能衰竭的治疗作用
• 1.2.1.3 对肾炎的治疗作用
• 1.2.2 保护呼吸系统、调节心血管系统的功能
• 1.2.3 机体免疫调节功能
• 1.2.4 抗肿瘤
• 1.2.5 抗氧化、清除体内自由基作用
• 1.2.6 神经系统调节作用
• 1.2.7 抗菌抗病毒作用
• 1.2.8 保护肝脏的作用
• 1.2.9 其他作用
• 1.3 课题的提出、目的和内容
• 1.3.1 课题的提出
• 1.3.2 课题的目的
• 1.3.3 课题的设计、研究内容
• 1.3.3.1 课题设计
• 1.3.3.2 研究内容
• 第二章 材料和方法
• 2.1 磷硫铁法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究
• 2.1.1 材料和仪器
• 2.1.1.1 材料
• 2.1.1.2 仪器
• 2.1.2 试剂和溶剂配制
• 2.1.2.1 试剂
• 2.1.2.2 10%FeCl3·6H2O磷酸溶液
• 2.1.2.3 磷硫铁显色液
• 2.1.2.4 麦角甾醇标准品制备
• 2.1.3 样品制备
• 2.1.4 实验方法
• 2.1.4.1 显色方法
• 2.1.4.2 测定波长检测方法
• 2.1.4.3 标准曲线绘制方法
• 2.2 香草醛-冰醋酸法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究
• 2.2.1 材料和仪器
• 2.2.1.1 材料
• 2.2.1.2 仪器
• 2.2.2 试剂和溶剂配制
• 2.2.2.1 化学试剂
• 2.2.2.2 香草醛-冰醋酸显色液
• 2.2.3 样品制备
• 2.2.4 实验方法
• 2.2.4.1 显色方法
• 2.2.4.2 测定波长确定方法
• 2.2.4.3 标准曲线绘制方法
• 2.3 超声波辅助提取中国被毛孢总甾醇
• 2.3.1 材料和仪器
• 2.3.1.1 材料
• 2.3.1.2 仪器
• 2.3.2 试剂和溶剂配制
• 2.3.3 实验方法
• 2.3.3.1 单因素分析皂化用碱量的影响
• 2.3.3.2 单因素实验分析乙醇浓度影响
• 2.3.3.3 单因素实验分析提取时间影响
• 2.3.3.4 单因素实验分析料液比影响
• 2.3.3.5 单因素实验分析提取次数影响
• 2.3.3.6 正交试验
• 2.4 热回流法提取中国被毛孢总甾醇
• 2.4.1 材料和仪器
• 2.4.1.1 材料
• 2.4.1.2 仪器
• 2.4.2 试剂和溶剂配制
• 2.4.3 实验方法
• 2.4.3.1 单因素实验分析热回流温度影响
• 2.4.3.2 正交试验
• 2.5 RP-HPLC测定中国被毛孢麦角甾醇含量
• 2.5.1 材料和仪器
• 2.5.1.1 材料
• 2.5.1.2 仪器
• 2.5.2 试剂和溶剂配制
• 2.5.2.1 试剂
• 2.5.2.2 麦角甾醇标准品配制
• 2.5.3 样品制备
• 2.5.4 实验方法
• 2.5.4.1 色谱条件
• 2.5.4.2 流动相的选择
• 2.5.4.3 标准曲线绘制方法
• 第三章:中国被毛孢总甾醇含量测定和提取方法研究
• 3.1 磷硫铁法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究
• 3.1.1 吸收波长的确定
• 3.1.2 标准曲线的建立
• 3.1.3 稳定性实验结果
• 3.1.4 精密度实验结果
• 3.1.5 回收率实验结果
• 3.1.6 分析与讨论
• 3.2 香草醛-冰醋酸法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究
• 3.2.1 吸收波长的确定
• 3.2.2 标准曲线的建立
• 3.2.3 稳定性试验
• 3.2.4 精密度试验
• 3.2.5 回收率试验
• 3.2.6 分析与讨论
• 3.3 正交优化超声波辅助提取中国被毛孢总甾醇方法
• 3.3.1 单因素分析皂化用碱量的影响
• 3.3.2 单因素实验分析料液比影响
• 3.3.3 单因素实验分析提取时间影响
• 3.3.4 单因素实验分析乙醇浓度影响
• 3.3.5 单因素实验分析提取次数的影响
• 3.3.6 正交试验结果
• 3.3.7 验证试验
• 3.3.8 分析与讨论
• 3.4 正交优化热回流提取中国被毛孢总甾醇方法
• 3.4.1 单因素分析热回流温度的影响
• 3.4.2 正交试验结果
• 3.4.3 验证试验
• 3.4.4 分析与讨论
• 3.5 小结
• 第四章 RP-HPLC测定中国被毛孢麦角甾醇含量
• 4.1 Hypersil BDS C18（210mm×4.6mm,5 m）色谱柱结果
• 4.1.1 100%甲醇流动相等度洗脱结果
• 4.1.2 90%甲醇流动相等度洗脱结果
• 4.1.3 乙腈/甲醇（75/25,V/V）流动相等度洗脱结果
• 4.1.4 A甲醇/水（80/20,V/V）,B甲醇/二氯甲烷（75/25,V/V）梯度洗脱结果
• 4.2 Hypersil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5m）
• 4.2.1 纯甲醇流动相色谱图
• 4.2.2 标准曲线绘制
• 4.2.3 中国被毛孢麦角甾醇含量测定
• 4.2.4 讨论
• 4.3 小结
• 总结
• 致谢
• 参考文献
• 附