论文摘要
【研究背景】肝脏移植是治疗终末期肝病的最佳方法乃至唯一的选择。决定肝脏移植成败的关键性问题之一是受体对移植器官的排斥反应，受体对移植器官的排异反应根源于T淋巴细胞的激活和增生。近年研究发现，T细胞的激活依赖于抗原递呈细胞提呈的双重信号：由抗原本身所介导的第一信号和共刺激分子（costimulatorymolecule）介导的第二信号。第一信号是指抗原呈递细胞（antigene presentcell，APC）呈递的抗原肽-主要组织相容性复合物（maior histocompatibilitycomplex，MHC），与特殊的T细胞受体（T cell receptor TCR）相结合，将信号传递给T细胞，第一信号即被激活；第二信号是共刺激信号（co-stimulation signal），即来自APC上的B7家族分子与其在T细胞上的配体CD28家族分子相结合产生的协同刺激信号。共刺激分子具有启动、维持以及调节活化级连反应的作用，决定了细胞是活化增殖，还是抑制或者转变为无反应状态（anergy），甚至凋亡（apoptosis）。任何一种信号的缺乏都不能达到引起T淋巴细胞的分化、增生以至排斥移植器官的免疫应答反应。T淋巴细胞所介导的排斥反应需要识别特异的抗原和细胞粘附分子介导的共刺激信号。共刺激信号对供体器官免疫排异反应的影响主要依赖于共刺激分子在抗原呈递细胞表面的表达。在器官移植中对供体器官的抗原是难以控制和调节的，阻断共刺激信号已经被证实为有效的抑制排异反应的方法。所有的B7样分子和它们的受体都是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。B7家族各成员之间有20％-35％氨基酸序列是相同的。B7-1（CD80）和B7-2（CD86）是研究得最广泛的T细胞协同刺激分子，二者分别结合的受体包括CD28、C，CTLA-4、ICOS、PD-1（程序性死亡分子）和BTLA（B、T细胞弱化因子）。所有这些协同信号分子不仅提供促进T细胞生长、分化和产生细胞因子的正向信号（CD28和ICOS），同时还能通过提供负向信号来限制、终止和／或减弱T细胞应答（CTLA-4、PD-1和BTLA）。改变这些协同分子的表达可以调控免疫的强度和方向。CTLA-4是研究得最为透彻的识别B7家族成员的抑制性受体，属CD28超家族成员，在氨基酸水平与CD28有31％的同源性。CTLA-4通过降低细胞因子IL-2和IL-2R的表达及使细胞阻滞于G1期来抑制T细胞的活化。CTLA-4Ig是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）与IgG Fc段的基因重组融合蛋白，Linsley等在1991年首次报导用基因工程方法制备出可溶性重组CTLA-4Ig融合蛋白，它能够阻断抗原特异性T细胞活化过程所必需的B7-CD28共刺激通路，导致抗原特异性T细胞无能或凋亡，对控制器官移植排斥反应的发生具有重要作用。本实验通过利用CTLA-4Ig对介导大鼠原位肝移植（ROLT）急性排斥反应起关键作用的细胞免疫反应的第二信号进行阻断，应用免疫组织化学和RT-PCR半定量技术分别检测B7-1和B7-2蛋白及B7-1和B7-2 mRNA的表达情况，观察CTLA-4Ig抑制供体肝细胞共刺激分子B7-1和B7-2的表达，以阻断抗原呈递细胞刺激机体免疫系统引起免疫应答所必需的共刺激信号，达到抑制受体对供肝的免疫排斥反应，从而进一步探讨动态检测B7分子的表达有助于观察肝移植排斥反应的进程。就所查的文献，国内尚未检索到关于肝移植术后共刺激分子B7表达与急性排斥反应进程关系研究的论文或报道。【目的】：建立大鼠原位肝移植（ROLT）急性排斥反应模型，观察应用CTLA-4Ig在大鼠肝移植术后对共刺激分子B7-1和B7-2的影响及其抗排斥反应的作用，探讨B7分子与移植后排斥反应进程的关系。【方法】：1．雄性近交系DA大鼠48只，购自哈尔滨医科大学实验动物中心，体重180-200g；雄性近交系Lewis大鼠48只，购自北京维通利华实验动物有限公司，体重160-200g；CTLA4-Ig购于BD Pharmingen公司；纯化抗大鼠CD80单克隆抗体、纯化抗大鼠CD86单克隆抗体购自美国BioLegend公司；RT-PCR试剂盒购自TOYOBO公司。2．采用“二袖套管”法，建立DA→Lewis大鼠配对组合的ROLT急性排斥反应模型，动物术前12h禁食不禁水。凡ROLT术后存活48h以上者纳入本研究，并按随机表法分为2组。实验分为A组：对照组（n=48）：DA→Lewis ROLT模型，术后48h腹腔内一次性注射生理盐水1ml，未进行任何治疗；B组：CTLA4-Ig组（n=48）：DA→Lewis ROLT模型，于术后48h腹腔内一次性注射CTLA4-Ig，75μg/只大鼠。然后2组动物分别于移植术后3，5，7，10d各随机选取6只处死收集血清标本与肝脏标本。3．一般情况观察观察2组受体鼠术后的精神状态，运动，食欲，耳廓和皮肤黄染程度，以及小便颜色。4．2组受体鼠分别于移植术后第3、5、7、10d天剖腹经腹主动脉取血3～6ml，于低温离心机3000r／min离心15min，取血清，分装后于-70℃冰箱保存备检。所取的所有标本避免反复冻融，于检测前2h置于2℃～8℃环境中解冻，所检测的肝功能指标有：谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）及直接胆红素（DBIL）。5．逆转录聚合酶链反应（PT-PCR）半定量：采用逆转录聚合酶链反应试剂盒（TOYOBO公司产品）提取组织标本总RNA，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，β-actin、B7-1和B7-2的引物序列参照Naosuke Kojima的文献报道，由上海鼎安科技有限公司合成。β-actin上游引物为：5’-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3’，下游引物为：5’-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3，扩增产物224bp；B7-1上游引物为：5’GC-CATTGCTGTCCTGTGATTAC 3’，下游引物为：5’ACTCAGTTATGTTGGGGGTAGG 3’，扩增产物314bp：B7-2上游引物为：5’GCTCGTAGTATTTTGGCAGGACC 3’，下游引物为：5’CGGGTATCCTTGCTTAGATGAGC 3’，扩增产物337bp。两步法RT-PCR反应检测B7-1、B7-2 mRNA表达。1％琼脂糖凝胶电泳，Alpha ImagerTM 2200凝胶成像系统观察电泳条带存入图像。以系统的SPOT DENSITY软件分别测量内参照和B7-1、B7-2基因扩增条带的密度，以B7-1、B7-2条带的密度与内参照管家基因的密度比值代表基因表达的相对水平，作扩增产物半定量分析。6．免疫组化：应用免疫组织化学SABC法，检测48例肝脏组织中B7-1、B7-2蛋白表达情况，分析B7-1、B7-2蛋白表达与肝移植急性排斥反应的关系。【结果】：1．对照组动物于术后3-4d起开始出现体重减轻，皮肤、耳廓黄染逐渐加深，行动迟缓，尿色深黄，7d以后精神明显萎靡，消瘦，毛发蓬乱、脱落；在术后7～14d内出现死亡，尸检发现，肝脏脾脏肿胀严重，腹腔内腹水不明显，套管及胆道支撑管无脱落、扭曲，无腹腔内出血等手术操作失误致死因素。CTLA4-Ig组动物术后7d内亦表现为精神较差，体质量减轻，但尿色清亮，无明显皮肤、耳廓黄染；7d以后精神食欲逐渐恢复正常，体重逐渐增加。2．各组大鼠于术后3、5、7、10天检测血清ALT、TBIL、DBIL指标，A组肝功能损伤明显，B组肝功指标各时像点之间变化不明显，其3项指标水平均明显低于对照组（P＜0.01）。3．B7-1 mRNA在B组低表达，而在A组则明显表达（P＜0.01）；B7-2 mRNA在B组低表达，而在A组则明显表达（P＜0.01）。各组间观察，可见B7-1mRNA和B7-2 mRNA表达随时间的延长、肝移植排斥反应的进展而逐渐增强。4．B7-1在B组低表达，而在A组明显表达（P＜0.01）；B7-2在B组低表达，而在A组明显表达（P＜0.01）。【结论】：1．B7-1和B7-2成为抑制肝移植急性排斥反应的新靶点。2．肝移植急性排斥反应大鼠之肝脏，共刺激分子B7-1和B7-2的表达明显上调；肝移植急性排斥反应大鼠肝脏之免疫原性由于B7-1和B7-2的上调而增高。3．肝移植术后应用CTLA-4Ig可以降低肝组织中B7-1和B7-2的表达，有效抑制急性排异反应。4动态检测B7分子的表达有助于观察肝移植排斥反应的进程。