香蕉AQP基因转化拟南芥的功能研究

论文摘要

香蕉是一年生草本植物,喜高温多湿,缺水时叶片变薄、果指变短,生长延缓,导致减产,所以对香蕉抗逆品种的选育是十分必要的。因此,挖掘香蕉本身所具有的抗逆基因资源,研究其真正的抗逆机理,成为重要的研究手段,基于这一目的,本实验室前期从香蕉果实成熟早期阶段的抑制差减杂交文库（SSH）中获得一个属于水通道蛋白家族基因的cDNA片段,并用RACE技术在香蕉果实中克隆到了该水通道蛋白基因的基础上,利用模式植物拟南芥进一步探讨该基因在抗逆方面的一些功能和作用机理,并希望能够通过操纵这类基因的表达方式,从而解决香蕉抗逆方面所面临的问题。水通道蛋白（aquaorins,AQPs）在植物中是定位于特定的细胞核膜区域的一类膜蛋白,其能使水和其他小分子如甘油、尿素以及一些离子在膜上进行渗透。MaAQP1（Musa acuminata aquaporin）包含861bp的完整阅读框架,编码的蛋白有6个跨膜结构及asparagine-proline-alanine （NPA）和aromatic/argnine2个保守区。在活体生物膜中,水通道蛋白以四聚体形式存在。许多的实验研究显示,植物能够通过调节AQP的活性响应各种非生物的胁迫。对MaAqP1在香蕉各主要器官的表达进行分析后发现,（?）MaAqP1在香蕉的各个器官中都有表达,而在根中的表达量最高,说明它在该器官中可能发挥较为重要的作用。对香蕉植株进行一系列的非生物胁迫,包括盐害、旱害、涝害、低温、乙烯利、伤害等,发现在高盐和干旱条件处理下,MaAqP1的表达被强烈诱导,在涝害、低温、乙烯利、伤害胁迫下的表达变化不明显,说明MaAqP1主要参与干旱和盐胁迫应答途径。在香蕉果实采后的自然成熟过程和外源乙烯诱导下,MaAqP1的mRNA水平呈现逐渐下调的趋势,而在用乙烯抑制剂1-MCP处理的果实,MaAqP1的表达却相反呈现出一种缓慢上升的趋势。这说明MaAqP1对乙烯信号有应答,可能是MaAqP1在果实采后成熟过程中通过调控水分的运输,从而对乙烯的生物合成起着负调控的作用。为了更深入了解MaAqP1在植物抗逆协迫中所具有的功能及其抗性机制,将MaAqP1构建到35S启动子驱动的植物表达载体pCAMBIA1304中,将其转入拟南芥中过量表达,利用模式植物拟南芥清晰的遗传背景来研究MaAQP1的胁迫应答机制。通过浸泡法将pCAMBIA 1304-MaAqP1植物表达载体转入拟南芥中,在T1代获得35株抗性植株,经PCR检测其中29株为MaAqP1阳性植株。选取T2代中符合3：1分离比规律的,获得T3代纯合株系,实验选取了五个株系进行Southern检测,其中分别有单拷贝插入和双拷贝插入的,对这五株转基因植株分别命名为L16、L13、L6、L8、L1-5。对转基因植株在拟南芥中各部位MaAqP1的表达量进行分析,该基因在拟南芥的各部位均有表达,其中在根部表达量最高,这个结果也与该基因在香蕉中各部位的表达量基本相符。通过对转基因和野生型拟南芥表型分析,发现转基因拟南芥的主根根系要比野生型的长,在培养基中生长3d的转基因拟南芥的根毛要比野生型的多。实验中选取了L16和L13两个独立的株系分别代表了不同的基因插入拷贝数,进一步研究MaAQP1转基因株系的抗胁迫机制。通过对拟南芥的干旱和盐胁迫处理发现,转基因拟南芥L16和L13在幼苗期对于干旱和盐的耐受能力要显著强于野生型,而且在用干旱和350mM的NaCl对各株系成年植株进行胁迫时发现,L16和L13在两种逆境胁迫条件下的存活率均大于野生型植株。因此,转基因拟南芥的根系变长,根毛增多的表型出现,可能对于水分更好地运输和调控,从而增加转基因拟南芥的抗逆性状有一定的关系。为了进一步了解MaAQP1所介导的植物抗逆性增强的分子机制,我们分析了胁迫处理下ABA/胁迫信号途径中基因的应答情况。在ABA/胁迫信号途径中ABA/胁迫应答基因中的部分基因对ABA和胁迫信号都有响应,而另一部分只对胁迫信号响应,其可以以不依赖于ABA的信号途径方式进行传递。实验结果显示了,在干旱和高盐胁迫条件下,对于ABA信号和胁迫信号共同响应的基因,转基因和野生型拟南芥表达量的变化在各处理时期内均一致,但是野生型的应答强度要大于转基因株系的,可能是由于MaAQP1的转入提高了拟南芥抵抗胁迫的能力,因此只有在较强的外界胁迫条件下,植物体内胁迫应答基因才会被高度的诱导从而强烈表达。而不依赖于ABA信号的应答基因在转基因和野生型植株中在各胁迫处理下的表达趋势均不一致。初步推测,MaAQP1介导的转基因植株中抗逆机制可能与依赖于ABA的信号传导途径相关。针对水通道蛋白对植物根部的调控作用,我们进一步分析了转基因植物中根部生长的作用机制。植物根系的生长是由多种因素进行调控的,其中包括了两种主要因素,种是水分和养分对植物根系的生长和发育的影响,另外一种是植物体内部的激素对根系生长的调控。水通道蛋白在植物中主要参与水分以及其他小分子物质的运输,因此我们想进一步了解该基因是否参与植物激素的调控途经,从而促进植物根部的生长。我们选取了植物激素类包括生长素、细胞分裂素、乙烯、油菜素内酯的几个相关基因,我们发现,这几个基因在转基因植株中的表达均远远高于野生型植株。从各类激素基因在转基因株系中的表达水平可以看出,油菜素内酯类、生长素类和细胞分裂素类基因的表达水平均要比乙烯类基因表达水平高,并且在转基因拟南芥中这三类激素的基因与乙烯类基因的比例要高于野生型,说明在转基因拟南芥中促进植物生长类的基因表达占主导地位。从实验结果分析得到,植物根部的生长发育并不仅仅由单一的激素调控的,而是可能以一类激素为主的激素之间的相互联络构成的一个信号网络进行调节的,而且与激素间的比例也有一定关系。因此本研究也为揭示水通道蛋白在调控植物内部激素的作用上奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 香蕉生产的重要性
• 1.1.1 香蕉的经济价值
• 1.1.2 香蕉的食用价值
• 1.1.3 香蕉抗逆品种改良的重要性
• 1.2 植物抗性基因的表达及研究现状
• 1.2.1 不同植物中的胁迫应答机制
• 1.2.2 非生物胁迫中的信号转导途径
• 1.2.3 胁迫应答基因的表达过程
• 1.3 植物根系生长相关基因研究现状
• 1.3.1 各种植物激素对根生长的影响
• 1.3.2 各激素间的相互联系
• 1.4 AQP1基因的研究现状
• 1.4.1 植物水通道蛋白的多样性
• 1.4.2 水通道蛋白与激素之间的关系
• 1.4.3 水通道蛋白与植物的抗逆性
• 1.4.4 水通道蛋白与种子萌发与成熟和果实成熟之间的关系
• 1.4.5 水通道蛋白与植物根之间的关系
• 1.5 在拟南芥中研究水通道蛋白的必要性
• 1.5.1 拟南芥的生物学特性
• 1.5.2 拟南芥的遗传学特性
• 1.5.3 拟南芥的分子生物学特性
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.7 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料、试剂及仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 香蕉植株的干旱处理
• 2.2.2 香蕉植株的盐胁迫处理
• 2.2.3 香蕉植株的低温胁迫处理
• 2.2.4 香蕉植株的涝害处理
• 2.2.5 香蕉植株伤害胁迫处理
• 2.2.6 香蕉植株的乙烯利处理
• 2.2.7 香蕉果实采后处理
• 2.2.8 香蕉各器官总RNA提取及cDNA合成
• 2.2.9 荧光定量PCR
• 2.2.10 拟南芥的遗传转化
• 2.2.11 转基因拟南芥的PCR检测与Southern blot分析
• 2.2.12 转基因拟南芥根的外部形态分析
• 2.2.13 转基因拟南芥的抗旱性分析
• 2.2.14 转基因拟南芥的耐盐性分析
• 2.2.15 转基因拟南芥胁迫相关基因的表达分析
• 2.2.16 拟南芥RNA提取及cDNA合成
• 2.2.17 荧光定量PCR分析各株系胁迫相关基因的表达
• 2.2.18 荧光定量PCR分析各株系根生长相关基因的表达
• 3 结果
• 3.1 MaAQP1在香蕉各器官中的表达分析
• 3.2 MaAQP1在果实成熟不同时期表达分析
• 3.3 MaAQP1对香蕉非生物胁迫的应答
• 3.3.1 MaAQP1对香蕉干旱胁迫的应答
• 3.3.2 MaAQP1对香蕉盐胁迫的应答
• 3.3.3 MaAQP1对香蕉低温胁迫的应答
• 3.3.4 MaAQP1对香蕉伤害胁迫的应答
• 3.3.5 MaAQP1对香蕉淹水胁迫的应答
• 3.3.6 MaAQP1对外源乙烯利的应答
• 3.4 转基因拟南芥PCR检测结果
• 3.5 转基因株系的Southern检测
• 3.6 转基因株系根的生长特性
• 3.7 转基因株系对Nacl的耐受性
• 3.7.1 转基因株系对Nacl的抗性测试
• 3.7.2 转基因株系对高浓度Nacl的耐受能力测试
• 3.8 转基因株系对干旱的耐受性
• 3.8.1 转基因株系对干旱的抗性测试
• 3.8.2 转基因株系对干旱的耐受能力测试
• 3.9 MaAQP1在转基因拟南芥中的表达（各种处理条件下的表达）
• 3.9.1 转基因株系在干旱胁迫下MaAQPl的表达
• 3.9.2 转基因株系在盐胁迫下MaAQP1的表达
• 3.10 干旱胁迫条件下各株系拟南芥中ABA/胁迫应答基因的差异表达
• 3.10.1 干旱胁迫条件下各株系依赖于ABA途径的胁迫应答基因的表达
• 3.10.2 干旱胁迫条件下各株系不依赖于ABA途径的胁迫应答基因的表达
• 3.11 Nacl胁迫条件下各株系拟南芥中ABA/胁迫应答基因的差异表达
• 3.11.1 Nacl胁迫条件下各株系依赖于ABA途径的胁迫应答基因的表达
• 3.11.2 Nacl胁迫条件下各株系不依赖于ABA途径的胁迫应答基因的表达
• 3.12 转基因拟南芥根中激素合成与信号转导相关基因差异表达
• 3.12.1 生长素相关基因的表达分析
• 3.12.2 乙烯相关基因的表达分析
• 3.12.3 细胞分裂素相关基因的表达分析
• 3.12.4 油菜素内酯相关基因的表达分析
• 3.12.5 各株系间激素比例差异分析
• 4 讨论
• 4.1 MaAQP1差异表达与香蕉果实成熟以及非生物胁迫的关系
• 4.2 MaAQP1提高了转基因拟南芥的耐盐性
• 4.3 MaAQP1提高了转基因拟南芥的抗旱性
• 4.4 MaAQP1转基因拟南芥中ABA/胁迫相关基因的表达分析
• 4.5 MaAQP1促进了拟南芥根的生长
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢