分泌型活载体炭疽杆菌疫苗的研究

论文摘要

炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）是一种革兰氏阳性杆菌,能引起人兽共患的烈性传染疾病,对人类的健康造成了严重的危害,我国将炭疽列为乙类传染病。同时炭疽芽孢杆菌是一种潜在的生物武器。因此,人们把炭疽杆菌及其疫苗的研究作为病原微生物及其疫苗研究领域的一个重点。利用沙门菌的分泌系统——ClyA分泌系统分泌展示炭疽杆菌的保护性抗原（PA）和佐剂（EFi、CTB、LTB）。该分泌系统结构简单,能将外源抗原分泌到胞外展示到细胞膜上。为了构建在非抗生素压力下也能够稳定存在的表达载体,选择了构建具有Asd+平衡致死系统（Balanced-lethal maintenance system）的表达载体,在该载体上克隆了一个asd基因,然后将其转化入asd基因缺失的沙门菌宿主中构建成了SC184菌株。从Salmonella enterica serovar Typhi染色体上克隆了clyA基因；从Bacillus anthracis突变株A16R上克隆得到pag基因及efn基因；从E.coli K12菌株上克隆了ltb基因和PompC启动子；从本实验室构建的pUCT1载体上的克隆到ctb基因；从pEGFP-N1载体上得到gfp基因,构建成了pSA184P、pSA184Pg、pSA184Pen、pSA184Pc和pSA184P1。将表达载体转化到伤寒沙门氏CVD908-htrA中构建成了SC184P, SC184PG、SC184PEn、SC184PC、SC184PL活载体候选疫苗株。通过流式细胞术、ELISA、Western-blot、荧光共聚焦显微镜分析等实验证明构建的活载体菌株能够表达外源抗原；ELISA、流式细胞术、提取外膜蛋白等实验证明活载体菌株表达的外源蛋白部分被表达、展示到菌体细胞表面。采用活载体候选疫苗株初免-蛋白加强免疫的方法免疫小鼠,免疫后14天进行血清学评价,发现SC184P、C184PEn、SC184PC免疫组小鼠的血清中PA特异性IgG水平较SC184免组要高很多。抗体中和毒素试验发现：SC184PEn、SC184PC、SC184P免疫组小鼠的血清稀释10倍时能够中和40-80%致死毒素；稀释到160倍时还具有较高的中和能力（20-40%）。用Bacillus anthracis疫苗株A16R芽孢（8×108CFU/只）攻击活载体候选疫苗株初免-蛋白加强免疫后的小鼠,SC184PEn、SC184PC免疫组小鼠保护率为33-50%；1×108CFU/只时SC184P组的保护率为16.7%, SC184PEn、SC184PC组为60%。总之,研究表明,构建的活载体菌株可以发展为一种良好的炭疽杆菌疫苗。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 前言
• 1 炭疽杆菌疫苗
• 2 分泌系统
• 2.1 Ⅰ型分泌系统
• 2.2 ClyA分泌系统
• 3 减毒沙门菌及其表达外源抗原
• 3.1 减毒沙门菌
• 3.2 沙门菌表达外源抗原
• 3.2.1 质粒载体
• 3.2.2 通过染色体表达外源抗原
• 4 黏膜免疫刺激
• 5 佐剂
• 5.1 CTB和LTB
• 5.2 EFn
• 第一部分 分泌型表达载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 质粒和菌株
• 1.1.2 酶与试剂
• 1.1.3 培养基及溶液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 PCR引物序列设计
• 1.2.2 PCR反应条件及体系
• 1.2.3 扩增产物的纯化
• 1.2.4 PCR产物克隆和感受态细胞的转化
• 1.2.5 阳性克隆的筛选
• 1.2.6 DNA测序
• 1.2.7 酶切及连接反应
• 1.2.8 超级感受态细胞的制备
• 1.2.9 生长曲线的测定
• 2 实验结果
• 2.1 构建pSA184载体
• 2.1.1 构建pSA184载体的过程
• 2.1.2 扩增目的基因和重组质粒的酶切分析
• 2.2 构建pSA184Pg表达载体
• 2.2.1 构建pSA184Pg表达载体的过程
• 2.2.2 扩增目的基因和重组质粒的酶切分析
• 2.3 构建pSA184P表达载体
• 2.3.1 构建pSA184P的过程
• 2.3.2 扩增目的基因和重组质粒的酶切分析
• 2.4 构建pSA184Pen表达载体
• 2.4.1 构建pSA184Pen表达载体过程
• 2.4.2 扩增目的基因和重组质粒的酶切分析
• 2.5 构建pSA184Pc
• 2.5.1 构建pSA184Pc的过程
• 2.5.2 扩增目的基因和重组质粒的酶切分析
• 2.6 构建pSA184P1
• 2.6.1 构建pSA184P1的过程
• 2.6.2 扩增目的基因和重组质粒的酶切分析
• 2.7 重组菌遗传稳定性分析
• 3 讨论
• 第二部分 外源蛋白的表达及定位分析
• 第一节 外源蛋白的表达
• 1 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 酶与试剂
• 1.1.3 主要的仪器
• 1.1.4 溶液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 SDS-PAGE
• 1.2.2 Western blot
• 1.2.3 超声破碎菌体
• M1的ELISA方法'>1.2.4 包被G_M1的ELISA方法
• 1.2.5 荧光共聚焦观察
• 1.2.6 流式细胞术分析
• 2 实验结果
• 2.1 外源蛋白的Western blot分析
• M1的ELISA分析'>2.2 包被G_M1的ELISA分析
• 2.3 重组菌荧光共聚焦观察
• 2.4 流式细胞术分析
• 3 讨论
• 第二节 外源蛋白的定位分析
• 1 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要的仪器
• 1.1.4 溶液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 全菌包被的ELISA分析
• 1.2.2 外膜蛋白的提取方法
• 1.2.3 流式细胞术分析
• 1.2.4 SDS-PAGE、Western blot
• 2 实验结果
• 2.1 全菌包被的EILSA分析
• 2.2 外膜蛋白的Western blot分析
• 2.3 流式细胞术分析
• 3 讨论
• 第三部分 候选疫苗株的动物免疫评价
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 动物及细胞
• 1.1.4 溶液
• 1.1.5 培养基的配制
• 1.1.6 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 重组菌的诱导表达及蛋白纯化
• 1.2.2 BCA蛋白定量方法
• 1.2.3 免疫评价
• 1.2.4 炭疽杆菌A16R株芽孢的制备及攻毒实验
• 1.2.5 中和滴度测定
• 2 实验结果
• 2.1 重组蛋白的诱导表达及纯化
• 2.2 活菌载体疫苗株的免疫学评价
• 2.3 炭疽杆菌A16R株芽孢的制备及攻毒实验
• 2.3.1 炭疽杆菌A16R株芽孢的制备
• 2.3.2 攻毒实验
• 2.4 中和滴度分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢