microRNA-138对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响及其与microRNA-346竞争性调控hTERT的研究

论文摘要

目的:肿瘤的发生与发展是多基因参与、多步骤完成的复杂生命现象,其发生的隐蔽性和不可预测性是肿瘤患者治疗过程中最重要的难题,也是威胁肿瘤患者生命的最重要原因。目前,对于其发生机制的研究已取得了很多的成就,其中端粒酶的激活被广泛的认识为肿瘤形成及恶化过程中的必须步骤。微小RNA（microRNA,miRNA,miR）是一类非编码调控单链小分子RNA,能够通过与靶基因特异性的碱基配对结合对靶基因进行转录后水平调控,几乎参与了所有生命活动的过程。研究表明,有些miRNA通过负调控抑癌基因或癌基因的表达水平,在肿瘤发生和发展过程中发挥极其重要的作用。本文旨在阐明在宫颈癌中具有明显高表达并维持恶性增殖的必须分子hTERT的miRNA的调节作用,并探索多种miRNA对单一靶分子的调节机制。方法:首先根据文献报道miR-138在甲状腺癌中靶定hTERT发挥抑癌基因的作用机制,利用Real-time PCR方法检测miR-138在人宫颈癌组织和癌旁正常组织中的差异表达,然后在人宫颈癌细胞系HeLa细胞中,通过过表达miR-138水平增强其功能后,利用MTT实验和集落形成实验分别检测细胞生长活性和增殖能力的变化。而后通过生物信息学方法预测miR-138靶定hTERT的结合位点,利用荧光报告载体实验验证miR-138对hTERT的直接调控作用。利用Real-time PCR和Western Blot实验技术检测miR-138功能增强的宫颈癌细胞或组织标本中靶基因mRNA和蛋白水平的表达变化,进一步验证miR-138对靶基因的调控作用。而后又利用挽救实验过表达hTERT后,通过MTT实验和集落形成实验分别检测细胞生长活性和增殖能力的变化,更进一步验证了 miR-138对hTERT调控的特异性。最后,我们通过荧光报告实验,Wstern Blot实验验证了 miR-138与miR-346共同的协调调控hTERT的表达,以调控宫颈癌细胞增殖。结果:Real-time PCR结果显示,miR-138在人宫颈癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织。在HeLa细胞中,过表达miR-138后,细胞生长活性明显受抑制;集落形成能力明显降低。通过生物信息学预测其结合位点,端粒酶催化亚单位hTERT是miR-138的候选靶基因,其3,非翻译区包含miR-138的潜在结合位点。荧光报告载体实验证实,miR-138能够通过作用于hTERT基因的3’非翻译区对其表达进行负性调节。而在miR-138功能增强的宫颈癌细胞或组织中,hTERT基因的蛋白表达水平有明显降低。在HeLa细胞中,针对miR-138引起的hTERT的表达,采用过表达不含UTR的hTERT基因后,细胞生长活性、集落形成能力明显恢复,证实了 miR-138对hTERT调控的特异性。最后,荧光报告载体实验,Western Blot实验验证了随着miR-346与miR-138在宫颈癌细胞中的比率变化,含有hTERT-3’UTR的EGFP荧光报告系统的荧光值及内源性hTERT表达水平逐渐变化,即hTERT的表达和miR-346正相关,与miR-138负相关。克隆形成实验验证了这种协调调控在细胞功能学上的作用。结论:在宫颈癌细胞中,miR-138能够抑制细胞增殖,起到抑癌基因的作用。宫颈癌中异常低表达的miR-138下调肿瘤相关基因hTERT的表达水平的能力降低,使hTERT的促增殖活性增强,造成细胞生长速度加快。通过阐明miR-138在宫颈癌中的具体作用机制有利于我们对恶性肿瘤的发生和发展进行深入的了解,同时也为肿瘤的诊断和治疗提供新依据。在此基础之上,我们发现了两个miR-346与miR-138共同协调调控靶基因hTERT的表达,充实了 miRNA在基因表达调控机制方面的新视角,使得我们认识到miRNA对靶基因的调控更加的多元化,精细化。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、miR-138在宫颈癌中的作用研究
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 Real-time PCR检测miR-138在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的差异表达
• 1.2.2 质粒的转染效率检测
• 1.2.3 转染pcDNA3/pri-miR-138的HeLa细胞中miR-138的表达水平
• 1.2.4 miR-138对宫颈癌细胞生长活性的影响
• 1.2.5 miR-138对宫颈癌细胞集落形成能力的影响
• 二、在宫颈癌中miR-138靶基因的筛选及验证
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 miR-138靶定hTERT的生物信息学预测
• 2.2.2 EGFP荧光报告载体质粒的构建
• 2.2.3 EGFP荧光报告载体实验验证hTERT是miR-138的直接靶基因
• 2.2.4 Real time PCR检测hTERT在转染miR-138的HeLa细胞中的表达
• 2.2.5 WB检测hTERT蛋白在转染miR-138的HeLa细胞中的表达
• 2.2.6 表达hTERT（不含3'UTR）的质粒的验证
• 2.2.7 pcDNA3/hTERT对宫颈癌细胞生长活性的挽救能力
• 2.2.8 pcDNA3/hTERT对宫颈癌细胞集落形成的挽救能力
• 三、miR-346和miR-138协调调控hTERT的表达
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 miR-138与miR-346对hTERT的结合位点的预测
• 3.2.2 不同剂量的miR-138和miR-346对hTERT表达的影响
• 3.2.3 不同剂量的miR-138和miR-346对HeLa细胞增殖能力的影响
• 3.2.4 不同突变hTERT-3'UTR质粒的构建
• 3.2.5 不同突变hTERT-3'UTR质粒验证miRNAs对hTERT调节的特异性
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 hTERT, p53及其相关micrRNAs在肿瘤中的调控关系
• 综述参考文献
• 致谢