Survivin对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及其相关的信号转导通路

论文摘要

子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤，以腺癌最常见。由于目前尚缺乏对子宫内膜癌发生发展的确切分子机制的了解，严重阻碍了有效预防的发展。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，具有调控细胞增殖和细胞凋亡的双重作用。近年来的研究表明，它在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。但其与子宫内膜癌发生发展的关系及其对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响研究甚少。本课题从研究survivin在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜、子宫内膜癌组织和细胞株中的表达入手，利用RNA干扰（RNAi）技术抑制了子宫内膜癌Ishikawa细胞中survivin的表达，并运用RT-PCR、western blot、Brdu实验、流式细胞仪检测、MTT、划痕实验、Matrigel体外侵袭实验等探讨它在子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和运动、侵袭过程中的作用。我们的实验结果提示survivin在子宫内膜癌中的异常表达及其作用可能是影响子宫内膜癌细胞生物学行为的重要因素之一。本课题共分四个部分：①Survivin在子宫内膜癌组织中的表达；②Survivin对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡的影响；③Survivin对子宫内膜癌细胞运动、侵袭能力的影响；④子宫内膜癌细胞中EGFR／Ras／Raf／MAPK信号通路对survivin表达的调控。第一部分Survivin在子宫内膜癌组织中的表达目的检测survivin在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜、子宫内膜癌组织和细胞株中的表达，探讨它与子宫内膜癌的关系。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot和免疫组织（细胞）化学方法检测survivin mRNA和蛋白在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜、子宫内膜癌组织和细胞株Ishikawa、HEC-1-A中的表达，并比较它们之间的表达差异。结果（1）Survivin mRNA在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜和子宫内膜癌组织中均有表达。Survivin mRNA在子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于不典型增生子宫内膜和正常子宫内膜组织（均为P＜0.05）。Survivin mRNA在两株子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1-A中均为强阳性表达。（2）Survivin蛋白在子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于不典型增生子宫内膜和正常子宫内膜组织（分别为P＜0.05和P＜0.01）。Survivin蛋白在两株子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1-A中也均为强阳性表达，与RT-PCR结果一致。Survivin蛋白在子宫内膜癌细胞中的表达部位主要是细胞浆。结论Survivin的过度表达可能与子宫内膜癌的发生有关。第二部分Survivin对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡的影响目的探讨survivin对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡的调控作用及其相关机制。方法针对survivin mRNA序列设计了三条survivin特异性的siRNAs和一条阴性对照non-target siRNA，并分别克隆入pRNA质粒载体。将重组质粒转染Ishikawa细胞，用RNAi抑制Ishikawa细胞中survivin的表达。采用RT-PCR和Western blot检测干扰效果，BrdU实验和流式细胞仪分别检测干扰前后细胞增殖和细胞凋亡的变化。并用Western blot检测了与细胞增殖密切相关的cyclin D1、cyclin E、p-RB的表达以及与凋亡密切相关的caspase-3、caspase-8、bcl-2的表达，初步探讨survivin调控细胞增殖和细胞凋亡的途径。结果（1）成功构建了三个针对survivin基因mRNA不同位点的重组质粒pRNAT-suv1，pRNAT-suv2，pRNAT-suv3和一个阴性对照质粒pRNAT-neg。其中两个质粒pRNAT-suv2和pRNAT-suv3特异并有效地抑制了Ishikawa细胞中survivin的表达，同未转染组和转染pRNAT-neg组相比，survivin mRNA的表达水平分别被抑制了（78.97±4.13）％和（80.23±5.42）％（均为P＜0.01）；survivin蛋白的表达水平分别被抑制了（81.61±3.45）％和（82.63±4.76）％（均为P＜0.01）。（2）RNA干扰survivin使细胞周期阻滞在G1期，显著抑制了细胞的增殖。四组细胞的增殖率分别为：未转染组（52.42±3.17）％，转染pRNAT-neg组（49.67±2.52）％，转染pRNAT-suv2组（33±2.65）％，转染pRNAT-suv3组（34±2.0）％。干扰组与阴性对照组分别比较，差异均有显著性（均为P＜0.01）。（3）细胞周期蛋白cyclin D1和p-RB在RNA干扰后表达明显下降，而cyclin E含量则无明显变化。（4）RNA干扰survivin诱导了细胞凋亡。四组细胞的凋亡率分别为：未转染组（2.17±0.05）％，转染pRNAT-neg组（3.99±0.17）％，转染pRNAT-suv2组（38.48±2.13）％，转染pRNAT-suv3组（39.39±2.55）％。干扰组与阴性对照组分别比较，差异均有显著性（均为P＜0.01）。（5）RNA干扰survivin使caspase-3和caspase-8裂解增加，而bcl-2的表达无明显变化。结论RNAi抑制survivin的表达可以抑制子宫内膜癌细胞的增殖，并促进其凋亡，其机制可能是通过下调cyclin D1和p-RB蛋白的表达水平以及增加caspase-3和caspase-8的裂解引起的。第三部分Survivin对子宫内膜癌细胞运动、侵袭能力的影响目的探讨survivin对子宫内膜癌细胞运动、侵袭能力的调节作用。方法将第二部分构建的重组质粒pRNAT-suv2和阴性对照质粒pRNAT-neg转染Ishikawa细胞，G418筛选稳定并有效表达pRNAT-suv2和pRNAT-neg的克隆。用western blot检测稳定表达克隆中survivin的干扰效果，并用划痕实验、Matrigel体外侵袭实验和western blot评价稳定并有效表达pRNAT-suv2的细胞与阴性对照组细胞运动、侵袭能力以及E-钙粘蛋白表达的差异。结果（1）稳定表达pRNAT-suv2的细胞其survivin的表达水平低于未转染的细胞和稳定表达pRNAT-neg的细胞。（2）稳定表达pRNAT-suv2的细胞其运动能力和侵袭能力均低于未转染的细胞和稳定表达pRNAT-neg的细胞（p＜0.01）。（3）稳定表达pRNAT-suv2的细胞其E-钙粘蛋白的表达水平高于未转染的细胞和稳定表达pRNAT-neg的细胞（p＜0.05）。结论RNAi抑制survivin的表达可以降低子宫内膜癌细胞的运动和侵袭能力，可能与E-钙粘蛋白的表达增加有关。Survivin的异常表达可能促进子宫内膜癌的浸润和转移。第四部分子宫内膜癌细胞中EGFR／Ras／Raf／MAPK信号通路对survivin表达的调控目的探讨子宫内膜癌细胞中EGFR／Ras／Raf／MAPK信号通路对survivin表达的调控。方法应用人重组生长因子EGF和TGF-α分别作用于Ishikawa细胞，Western blot分析不同时间MAPK信号通路关键分子ERK1／2的磷酸化和survivin蛋白的表达。并且应用特异性的MAPK通路阻断剂U0126抑制ERK1／2的磷酸化，观察阻断MAPK通路后survivin蛋白表达的变化。结果（1）EGF和TGF-α均迅速诱导了ERK1／2的磷酸化，激活了MAPK通路，并使survivin蛋白表达增加了8.35倍和9.42倍。（2）应用MAPK通路阻断剂U0126预处理细胞则完全抑制了EGF和TGF-α诱导的ERK1／2磷酸化，阻断了MAPK通路的激活，并使得EGF和TGF-α上调survivin蛋白表达的作用消失。结论子宫内膜癌中EGF和TGF-α能够通过激活MAPK信号通路上调svrvivin蛋白的表达。MAPK通路是调控survivin蛋白表达的一个上游信号转导通路。综上所述，survivin在子宫内膜癌中过度表达，并可促进子宫内膜癌细胞增殖和侵袭，抑制其凋亡。EGFR／Ras／Raf／MAPK信号通路是调控survivin蛋白表达的一个上游信号转导通路。本课题为进一步研究子宫内膜癌的发病机制提供了新的思路，并为子宫内膜癌的基因治疗提供了新的靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 Survivin在子宫内膜癌组织中的表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Survivin对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 Survivin对子宫内膜癌细胞运动、侵袭能力的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 子宫内膜癌细胞中EGFR/Ras/Raf/MAPK信号通路对survivin表达的调控
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 在读博士期间发表的文章
• 致谢