中国被毛孢胞内多糖的分离纯化与初步结构分析

论文摘要

冬虫夏草是我国传统的名贵中药材，具有多种药效，而多糖是其药理活性的物质基础之一。中国被毛孢（Hirsutella sinensis）是冬虫夏草的无性型,本课题以中国被毛孢菌丝体为原料，采用水提醇沉、有机溶剂洗涤的方法获取了粗多糖。对于粗多糖混杂的淀粉，采用α-淀粉酶或β-淀粉酶和异淀粉酶组合进行水解， DNS法检测酶解释放的还原糖产生，碘-碘化钾试剂检测淀粉残留，发现β-淀粉酶和异淀粉酶组合在30℃、pH4.8、料酶比=25:4（w/w）的条件下酶解6h或α-淀粉酶在57℃、pH5.8、料酶比=25:1的条件下酶解6h，可以将粗多糖中的淀粉去除干净。用DEAE-纤维素阴离子交换层析（2.6×50cm）的方法对去淀粉后的粗多糖进行初步的分离，用含有盐离子的Tris-Hcl缓冲液进行梯度洗脱，梯度分别设置为0%15%50%100%三个阶段、2mL/管进行收集，用苯酚-硫酸法检测糖峰，分别在0%和015%的盐溶液梯度中获得两组主要多糖——HST-1和HST-2。HST-1进一步用硼酸-硼砂缓冲液梯度洗脱，在不含盐离子的缓冲液中洗脱得到单一的多糖峰（HSP-A1）和在015%盐溶液硼酸-硼砂缓冲液梯度中洗脱获得多糖峰（HSP-B1）。通过GPC研究，分别用0mol/L、0.005mol/L、0.01mol/L、0.02mol/L等不同浓度的NaAc溶液洗脱，得到在0.005mol/LNaAc溶液的条件下糖峰的分离度最好；并运用GPC2000软件分析在0.005mol/LNaAc溶液中洗脱的各个峰的分子量的大小，进而确定了下一步凝胶色谱分离所需凝胶条件——SephadexG-100。在运用SepHadex G-100，洗脱剂为0.005mol/LNaAc，流速为0.5mL/min,5mL/管进行收集，苯酚硫酸法检测的条件下对HSP-A1和HSP-B1根据分子量的大小进行进一步的纯化，在运用上述条件的基础上，这部分实验根据色谱柱的分辨率分为三个部分：第一部分是运用2.8×50cm色谱柱分别对HSP-A1和HSP-B1进行两次重复上样纯化，从HSP-A1和HSP-B1中分别分离纯化得到含糖量较高的糖峰HSN-A3和HSN-B1；第二部分是运用1.8×100cm色谱柱对HSN-A3和HSN-B1进一步纯化，得到HSN-A3和HSN-B1都只产生一个对称的多糖峰，说明两个样品的纯度都已经很高；第三部分是通过HPLC纯化，条件为TSK-GEL,G4000SW凝胶柱（7．5mmx300mm），柱温25℃，用0.005mol/L的NaAc溶液洗脱，流速0.5mL/min，用示差检测仪进行检测记录图谱，并通过HPLC检测最终样品的纯度，最终获得两个单一的、峰形对称、纯度达95%以上的的纯品HSH-3和HSH-4。运用HPLC和化学衍生化方法联用、红外、Varian400NMR等分析手段对HSH-4进行初步的结构分析，根据GPC2000软件分析结果表明，HSH-3的分子量为1.2×104Da，HSH-4的分子量为5.3kDa。其中HSH-4主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔百分比分别为6.62:1.00:1.27；是一种α-构型的吡喃型多糖；以α-1,3-糖苷键为主链、α-1,6-糖苷键为支链。综上所述HSH-4是一种以含甘露糖、葡萄糖、半乳糖为主的，以α-1,3-糖苷键为主链、α-1,6-糖苷键为支链的吡喃型杂多糖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 冬虫夏草生活史
• 1.1.1 冬虫夏草生命周期
• 1.1.2 虫草蝙蝠蛾生命周期
• 1.1.3 冬虫夏草有性型
• 1.1.4 冬虫夏草无性型
• 1.2 冬虫夏草的生存现状
• 1.3 冬虫夏草药理作用
• 1.3.1 免疫调节作用
• 1.3.2 抗肿瘤作用
• 1.3.3 抗氧化
• 1.3.4 调节血糖作用
• 1.3.5 保护肺的功能
• 1.3.6 其它
• 1.4 冬虫夏草活性成分
• 1.4.1 核苷类化合物
• 1.4.2 多糖类成分
• 1.4.3 甾醇及糖醇类成分
• 1.4.4 氨基酸成分
• 1.4.5 其它成分
• 1.5 多糖研究
• 1.5.1 多糖的提取
• 1.5.2 多糖的分离纯化方法
• 1.5.3 多糖的结构分析
• 1.5.3.1 化学方法
• 1.5.3.2 色谱学方法
• 1.5.3.3 波谱学方法
• 1.5.4 冬虫夏草多糖结构目前研究现状
• 1.5.5 多糖结构研究存在的问题
• 1.6 课题研究的目的与意义
• 1.7 采取的研究方法和技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 主要材料和试剂
• 2.1.3 溶液配制方法
• 2.2 方法
• 2.2.1 去除脂类等物质
• 2.2.2 中国被毛孢孢内多糖的提取
• 2.2.3 粗多糖的洗涤
• 2.2.4 去除淀粉方法研究
• 2.2.4.1 标准曲线的制定
• 2.2.4.2 用β - 淀粉酶和异淀粉酶去除淀粉
• 2.2.4.3 用α -淀粉酶去除淀粉
• 2.2.5 脱去盐离子和小分子
• 2.2.6 Tris- Hc l 缓冲液 DEAE - 52 纤维柱分离层析
• 2.2.6.1 Tris- Hcl 缓冲液 DEAE - 52 纤维素预实验
• 2.2.6.2 Tris- Hcl缓冲液DEAE- 52 分离层析制备柱实验
• 2.2.7 SephadexG- 5 脱盐
• 2.2.8 硼酸 -硼砂缓冲液 DE AE - 52 纤维素分离层析
• 2.2.8.1 样品 A 硼酸 - 硼砂缓冲液 DE AE - 52 纤维素分离预实验
• 2.2.8.2 样品 A 硼酸 - 硼砂缓冲液 DE AE -52 分离层析制备柱实验
• 2.2.8.3 样品 B 硼酸 - 硼砂缓冲液 DE AE - 52 纤维素分离预实验
• 2.2.8.4 样品 B 硼酸 - 硼砂缓冲液 DE AE - 52 分离层析制备柱实验
• 2.2.9 GP C 实验
• 2.2.9.1 样品的配制
• 2.2.9.2 色谱柱的条件
• 2.2.9.3 检测
• 2.2.10 两次 2.8×50c m柱子SephadexG- 100 分离层析
• 2.2.11 1.8×100c m 柱子SephadexG- 100 分离层析
• 2.2.12 GP C 分离
• 2.2.13 HSH- 4 和 HSH-3 分子量的测定
• 2.2.14 HSH- 4 单糖组成分析
• 2.2.14.1 单糖标准品的衍生化
• 2.2.14.2 样品衍生化
• 2.2.14.3 HPLC 分析条件
• 2.2.15 红外光谱结构分析
• 2.2.16 核磁共振结构分析
• 第三章 中国被毛孢胞内多糖的分离纯化
• 3.1 去除淀粉
• 3.2 透析
• 3.3 离子交换层析
• 3.3.1 Tris- Hcl 缓冲液离子交换层析结果
• 3.3.2 SephadexG- 15 脱盐
• 3.3.3 硼酸 -硼砂缓冲液离子交换层析结果
• 3.4 GP C 研究结果
• 3.5 两次 2.8 × 50 cm柱子SephadexG- 100 分离层析结果
• 3.6 1.8×100cm 柱子SephadexG- 100 分离层析
• 3.7 HP L C 分离结果
• 3.8 纯度鉴定
• 3.9 HSH -4 和 HSH- 3 分子量
• 3.10 讨论
• 第四章 中国被毛孢胞内多糖（ HSH -4 ）的初步结构分析
• 4.1 HSH -4 单糖组成
• 4.2 HSH -4 红外光谱分析结果
• 4.3 NMR 分析结果
• 4.4 讨论
• 致谢
• 参考文献