论文摘要
近年来神经干细胞方面的研究已成为神经科学研究领域的热点,干细胞的体外分离、培养、纯化和鉴定技术已经相对成熟,神经干细胞替代治疗神经系统疾病也逐渐走向临床应用阶段,但具体的移植途径、移植条件及移植时间窗等问题目前尚未形成统一的规范和标准,本实验通过对大鼠大脑中动脉缺血模型（MCAO）进行亚低温条件下神经干细胞脑内移植,观察亚低温条件下移植神经干细胞对大鼠缺血性脑卒中的治疗作用,探讨对脑卒中患者进行细胞移植替代治疗在移植途径、移植条件和移植时间窗等方面的问题,并印证神经干细胞替代治疗的可行性和可靠性。目的:探讨大鼠胚胎神经干细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的优化条件和效率。方法:从孕13.5天Sprague-Dawley（SD）大鼠胎鼠的大脑皮层中分离出神经干细胞,采用含有bFGF、EGF、N2和B27因子的DMEM/F12联合培养基培养、纯化出神经干细胞,并应用免疫荧光法进行鉴定;选用270±20gSD成年大鼠,采取改良Koizumi线栓法制作大鼠MCAO模型;在诱导大鼠亚低温条件下,选取第三代、生长旺盛的神经干细胞球制成的单细胞悬液对模型大鼠进行脑内移植,移植前3天对神经干细胞做BrdU标记,移植后35天进行行为学检测、神经功能评分并取脑进行免疫组化分析。结果:从孕13.5天的胎鼠大脑皮层中成功分离出神经干细胞,在加入bFGF、EGF、N2和B27因子的DMEM/F12（1:1）体外培养基中能够稳定生长、扩增神经干细胞,Nestin荧光染色阳性,分化14天后分别经NeuN、GFAP和GalC染色呈阳性结果,证明培养的细胞为神经干细胞;大鼠MCAO模型制作成功后7天,脑大体标本可见明显缺血软化灶形成且位置恒定,说明模型制作成功;细胞移植35天后,与阴性对照组相比,阳性对照组与亚低温实验组神经功能评分在统计学上有显著差异,移植位点均检测到BrdU阳性神经干细胞,免疫组化结果发现移植的干细胞存在分化并且形成NeuN阳性的神经元。结论:应用含有bFGF、EGF、N2和B27联合培养基,可从孕13.5天胎鼠大脑皮层中分离培养出神经干细胞并应用于进一步的实验研究;制作出成功率较高、重复性好的大鼠MCAO实验动物模型;亚低温条件下联合移植神经干细胞可在大鼠脑缺血灶局部存活和分化,其移植效果在行为学和组织学上优于单纯神经干细胞移植。
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