重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的复性研究

论文摘要

重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ（rhDNaseⅠ）是特异性的DNA水解酶，它是由260个氨基酸组成包含2个二硫键。DNaseⅠ与系统性红斑狼疮、胃肠道肿瘤和心肌梗死的发生密切相关。目前商品化的DNaseⅠ已用于治疗系统性红斑狼疮和囊性纤维化病。虽然人DNaseⅠ可以从尿液中获得，但尿液中人DNaseⅠ质量浓度很低、批间差异大，因此采用基因工程法制备rhDNaseⅠ将具有很大的优势。本文以重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ包涵体作为研究对象，首先为了获得大量的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的包涵体，对基因工程菌的发酵条件进行了优化；接下来研究了使用稀释法复性rhDNaseⅠ包涵体；然后根据稀释复性法得到了相关数据，为了提高包涵体的复性效果，研究了使用三种透析复性和三种凝胶过滤色谱复性rhDNaseⅠ包涵体。重组人DNaseⅠ基因工程菌在37℃培养时，不表达目标蛋白，经IPTG诱导后能表达重组人DNaseⅠ，但是表达的重组人DNaseⅠ以包涵体形式存在。基因工程菌在37℃，培养3h后加入IPTG诱导，培养基组成为1.6%Try，1%YE，0.5%NaCl，发酵条件为接种量2%，装液量20%，170r/min为最优发酵条件。采用上述试验方案进行发酵试验时，表达的重组人DNaseⅠ包涵体占菌体总蛋白的27.7%。每升发酵液可获得包涵体0.16g（干重）。重组人DNaseⅠ基因工程菌的破碎使用超声波法。破碎完毕后离心获得重组人DNaseⅠ的包涵体粗品。包涵体粗品中含有大量的杂质，在复性前首先将包涵体洗涤纯化。包涵体洗涤液可以有效的去除可溶性的杂蛋白，洗涤后精制包涵体的纯度可以达到90%以上。在4℃条件下，使用脉冲法向含有2mol/L尿素的复性缓冲液中加入重组人DNaseⅠ包涵体变性溶液，蛋白浓度控制在100g/mL300g/mL之间时，稀释复性可以得到最佳的复性效果。在稀释复性的基础上，使用三种透析法复性重组人DNaseⅠ的包涵体，均得到了具有生物学活性的目标蛋白。三种透析复性都是通过透析作用逐渐降低包涵体变性溶解液中尿素的浓度来使包涵体蛋白恢复生物活性，但是具体的操作具有很大差别。这导致了三种透析复性法得到的复性蛋白在酶活、质量回收率和纯度方面都不同，总体上来说，连续透析法优于分步透析法优于直接透析法。使用三种凝胶过滤色谱法也都成功地复性了重组人DNaseⅠ，与传统的稀释复性相比，它能在高蛋白起始浓度下对变性蛋白进行复性，活性回收率较高，复性的同时又使复性蛋白得到了一定程度的纯化。尿素浓度梯度凝胶过滤色谱和改良的非尿素浓度梯度凝胶过滤色谱通过在色谱柱上层构建尿素浓度梯度来实现线性去除变性蛋白液中的变性剂。三种方法综合比较：尿素梯度凝胶色谱复性效率更高，而改良的非尿素浓度梯度凝胶色谱复性效率也很好，而且操作简单。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 使用大肠杆菌工程菌表达基因重组蛋白质
• 1.2 包涵体蛋白的重折叠复性
• 1.2.1 包涵体的物理化学性质
• 1.2.2 包涵体蛋白的形成原因
• 1.2.3 包涵体蛋白的分离纯化与溶解变性
• 1.2.3.1 包涵体蛋白的分离与纯化
• 1.2.3.2 包涵体蛋白的溶解变性
• 1.2.4 包涵体蛋白的重折叠复性
• 1.2.4.1 包涵体蛋白重折叠复性的原理
• 1.2.4.2 包涵体蛋白重折叠复性的方法
• 1.3 脱氧核糖核酸酶Ⅰ
• 1.3.1 脱氧核糖核酸酶的分类
• 1.3.2 DNaseⅠ的理化性质和生物学作用
• 1.3.2.1 DNaseⅠ的理化性质
• 1.3.2.2 DNaseⅠ的生物学作用
• 1.3.3 DNaseⅠ的分子生物学
• 1.3.3.1 DNaseⅠ的基因
• 1.3.3.2 DNaseⅠ的表达分布
• 1.3.4 DNaseⅠ的分子结构和空间构象
• 1.3.4.1 DNaseⅠ的分子结构
• 1.3.4.2 DNaseⅠ的空间构象
• 1.3.5 DNaseⅠ的生产方法
• 1.3.5.1 天然提取法
• 1.3.5.2 基因工程法
• 1.3.6 复性后 DNaseⅠ的检测方法
• 1.4 研究思路
• 第二章 重组人 DNaseⅠ基因工程菌发酵条件的优化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料和实验仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 菌种活化
• 2.3.2 种子液培养
• 2.3.3 发酵过程中各因素对基因工程菌目标蛋白表达的影响
• 2.3.3.1 基因工程菌生长曲线的研究
• 2.3.3.2 培养基组成对基因工程菌目标蛋白表达的影响
• 2.3.3.3 发酵条件对基因工程菌目标蛋白表达的影响
• 2.4 分析方法
• 2.4.1 菌体浓度测定
• 2.4.2 重组人 DNaseⅠ表达水平测定
• 2.5 试验结果与讨论
• 2.5.1 人 DNaseⅠ基因工程菌的生长
• 2.5.2 重组人 DNaseⅠ的表达情况
• 2.5.3 YE 和 Try 重组人 DNaseⅠ表达水平的影响
• 2.5.4 发酵条件对重组人 DNaseⅠ表达水平的影响
• 2.6 本章小结
• 第三章 重组人 DNaseⅠ包涵体的预处理及复性研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 包涵体的制备
• 3.3.2 包涵体的洗涤
• 3.3.3 包涵体蛋白的溶解变性
• 3.3.4 包涵体溶解蛋白的稀释复性
• 3.4 分析方法
• 3.4.1 包涵体纯度测定
• 3.4.2 蛋白浓度测定
• 3.4.3 DNaseⅠ活性测定
• 3.4.3.1 琼脂糖电泳法检验酶活
• 3.4.3.2 单向酶扩散法测定酶活
• 3.4.3.3 紫外吸收法定量测酶活
• 3.5 试验结果与讨论
• 3.5.1 细胞破碎与包涵体制备
• 3.5.2 DNaseⅠ包涵体的洗涤和溶解变性
• 3.5.3 重组人 DNaseⅠ包涵体稀释复性的研究
• 3.5.3.1 重组人 DNaseⅠ包涵体变性液稀释倍数对重折叠的影响
• 3.5.3.2 尿素浓度对重组人 DNaseⅠ复性的影响
• 3.5.3.3 温度对重组人 DNaseⅠ复性的影响
• 3.5.3.4 加样方式对重组人 DNaseⅠ复性的影响
• 3.5.3.5 重组人 DNaseⅠ的活性检测
• 3.6 本章小结
• 第四章 重组人 DNaseⅠ包涵体的透析复性的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 重组人 DNaseⅠ包涵体蛋白溶解液的制备
• 4.3.2 直接透析法复性包涵体溶解蛋白
• 4.3.3 分步透析法复性包涵体溶解蛋白
• 4.3.4 连续透析法复性包涵体溶解蛋白
• 4.4 分析方法
• 4.4.1 蛋白浓度测定
• 4.4.2 SDS PAGE
• 4.4.3 DNaseⅠ活性测定
• 4.4.3.1 琼脂糖电泳法检验酶活
• 4.4.3.2 单向酶扩散法测定酶活
• 4.4.3.3 紫外吸收法定量测酶活
• 4.5 实验结果与讨论
• 4.5.1 透析法复性重组人 DNaseⅠ
• 4.5.1.1 直接透析法复性重组人 DNaseⅠ
• 4.5.1.2 分步透析法复性重组人 DNaseⅠ
• 4.5.1.3 连续透析法复性重组人 DNaseⅠ
• 4.5.2 三种透析法复性的比较
• 4.6 本章小结
• 第五章 重组人 DNaseⅠ包涵体的凝胶过滤色谱复性的研究
• 5.1 引言
• 5.2 试验材料和仪器
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 试验仪器
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 重组人 DNaseⅠ包涵体溶解蛋白的制备
• 5.3.2 凝胶过滤色谱复性重组人 DNaseⅠ包涵体
• 5.3.2.1 非尿素梯度的凝胶过滤色谱复性
• 5.3.2.2 尿素梯度的凝胶过滤色谱复性
• 5.3.2.3 改良的非尿素梯度的凝胶过滤色谱复性
• 5.4 分析方法
• 5.4.1 蛋白浓度测定
• 5.4.2 SDS PAGE
• 5.4.3 DNaseⅠ活性测定
• 5.4.3.1 琼脂糖电泳法检验酶活
• 5.4.3.2 单向酶扩散法测定酶活
• 5.4.3.3 紫外吸收法定量测酶活
• 5.5 实验结果与讨论
• 5.5.1 凝胶过滤色谱复性重组人 DNaseⅠ
• 5.5.1.1 非尿素梯度的凝胶过滤色谱复性重组人 DNaseⅠ
• 5.5.1.2 尿素梯度的凝胶过滤色谱复性重组人 DNaseⅠ
• 5.5.1.3 改良的非尿素梯度的凝胶过滤色谱复性重组人 DNaseⅠ
• 5.5.2 三种凝胶色谱过滤复性的比较
• 5.5.2.1 三种复性方法的酶活性
• 5.5.2.2 三种复性方法色谱图像的比较
• 5.5.2.3 色谱条件的变化对三种复性方法的影响
• 5.6 本章小结
• 第六章 结论与建议
• 6.1 结论
• 6.2 建议
• 参考文献
• 附录
• 附录一 实验材料与试剂
• 附录二 实验仪器
• 致谢
• 发表的学术论文
• 作者及导师简介
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书